實驗原理

ELISA實驗原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合,此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性,也不影響酶的生物學(xué)活性。

ELISA的發(fā)展史:
1√ 目,分子生物學(xué)正在并肯定會讓我們對整個生命科學(xué)有一個全面而*的認識,其對免疫測定技術(shù)發(fā)展的影響也是直接而又有效的。

2√ ELISA測定技術(shù)的發(fā)展主要在于方法學(xué)的發(fā)展,而方法學(xué)的發(fā)展依托于試劑生產(chǎn)技術(shù)不斷進步更新和型標記物的應(yīng)用。

3√ ELISA試劑盒它使我們對以一些難以檢測的生物活性物質(zhì)的測定變得輕而易舉,并且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

新手實驗注意事項:
新手以及那些沒有固定協(xié)作供貨商的顧客購買時往往有兩種疑慮,要便是價格,其次,便是質(zhì)量,國內(nèi)試劑盒相關(guān)于進口試劑盒來說價格自然會低許多。

關(guān)于新手的視點來說價格低并不必定就會考慮購買,同時還在猶疑質(zhì)量問題,由于沒有用過新品牌的試劑盒心中總是在懷疑。

利用交叉實驗即可辨別是否造假:小鼠ELISA檢測試劑盒說明書
1、取出購買的試劑盒A的包被板兩條。
2、一條包被板加試劑盒A的標準品做標準曲線。
3、另一條包被板加試劑盒B的標準品做標準曲線。
4、后續(xù)操作按照試劑盒說明書進行,加檢測抗體、酶復(fù)合物和底物。

我司在科研域積累了豐富的經(jīng)驗,正是為了幫助中國的相關(guān)單位能夠利用我司的經(jīng)驗與技術(shù)優(yōu)勢,為中國民眾提供更安全,快捷的生命域。

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做ELISA標準曲線時需要重點注意的細節(jié)問題:
1、設(shè)置標準曲線樣品的標準濃度范圍要有一個比較大的跨度,并且要能涵蓋你所要檢測實驗樣品的濃度,即樣品的濃度要在標準曲線濃度范圍之內(nèi),包括上限和下限;而對于呈S型的標準曲線,盡量要使實驗樣品的濃度在中間坡度陡段,即曲線幾乎成直線的范圍內(nèi)。
2、檢測標準樣品時,應(yīng)按濃度遞增順序進行,以減少高濃度對低濃度的影響,提高準確性。
3、標準曲線的樣品數(shù)一般為7個點,但至少要保證有5個點。
4、做出的標準曲線相關(guān)系數(shù)因?qū)嶒炓蟛煌兴儎?但一般來說,相關(guān)系數(shù)R至少要大于0.98,對于有些實驗,至少要0.99甚至是0.999。
5、樣品的濃度等指標是根據(jù)標準曲線計算出來的,所以先要把做標準曲線看作是比做正式實驗還要重要的一件事,否則后面的實驗結(jié)果無從談起。
6、好采用倍比稀釋法配制標準曲線中的標準樣品濃度,這樣就能夠保證標準樣品的濃度不會出現(xiàn)較大的偏離。

操作步驟:

1. 包被過程(注意設(shè)置空白對照,陰性對照):

將所用抗原用包被稀釋液稀釋到適當(dāng)濃度(一般所需抗原包被量為每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;棄去孔中液體.(為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋或?qū)迤椒旁诘撞坑袧窦啿嫉慕饘贊窈兄?

2. 封閉酶標反應(yīng)孔:

5%小牛血清置37℃封閉40min.封閉時將封閉液加滿各反應(yīng)孔,并去除各孔中的氣泡,封閉結(jié)束后用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.
洗滌方法:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,將洗滌液注滿板孔,放置2min略作搖動,吸干孔內(nèi)液,傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌次數(shù)3次

3. 加入待檢測樣品(建立合適的濃度梯度):

檢測時一般采用1:50-1:400的稀釋度, 應(yīng)采用較大稀釋體積進行,一般保證樣品吸取量>20μl.
將稀釋好的樣品加入酶標反應(yīng)孔中,每樣品至少加雙孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗滌液滿孔洗滌3遍,每遍3min.

4. 加入酶標抗體:

酶標抗體: 根據(jù)酶結(jié)合物提供商提供的參考工作稀釋度進行. 37℃,30-60min之間.短于30min往往結(jié)果不穩(wěn)定.每孔加100μl.洗滌同。

5. 加入底物液(現(xiàn)用現(xiàn)配):

TMB-過氧化氫尿素溶液,OPD-過氧化氫底物液系統(tǒng)次之.
底物加入量:每孔100μl,置37℃避光放置3-5分鐘,加入終止液顯色.

6. 終止反應(yīng):

每孔加入終止液50μl終止反應(yīng),于20min內(nèi)測定實驗結(jié)果.

7. 結(jié)果判斷:

OPD顯色后采用492nm波長,TMB反應(yīng)產(chǎn)物檢測需要450nm波長.檢測時一定要行空白孔系統(tǒng)調(diào)零.用測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均值的比值(P/N)表示,當(dāng)P/N大于2時作為抗體的效價.(數(shù)值的大小依具體檢測要求而定.)

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試劑盒 必知說明:
1)只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果,
2)不能混用其他制造商的產(chǎn)品,只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到好的檢測結(jié)果。
3)由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析,本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
4)實驗結(jié)果與試劑盒的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)。
5)請務(wù)必準備充足的標本備份。
6)不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別,
如:檢測限、靈敏度以及顯色時間等,請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作,網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

化學(xué)實驗室守則:
1. 實驗室要保持安靜,嚴禁大聲喧嘩、吵鬧。
2. 在實驗,要預(yù)先作好實驗準備,進入實驗室時,要有秩序,按規(guī)定的座位就座。
3. 實驗,必須了解清楚實驗內(nèi)容、目的、要求和實驗步驟。
4. 實驗開始時,應(yīng)先查點儀器、產(chǎn)品是否齊全,不得隨意調(diào)換,如發(fā)現(xiàn)問題,及時報告。
5. 實驗必須按步驟進行,并仔細觀察,做好記錄,實驗后后及時寫好實驗報告。
6. 實驗時,要愛護儀器,節(jié)省產(chǎn)品,由于違反操作規(guī)程而損壞丟失的儀器,必須賠償。
7. 實驗結(jié)束,要將儀器整理或清洗,保持桌面,室內(nèi)的整潔后才能離開。
8. 本守則在實驗都應(yīng)需知。

原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司