企業(yè)檔案
- 會員類型：免費會員
- 工商認證： 【已認證】
- 最后認證時間：
- 法人：
- 注冊號：
- 企業(yè)類型：生產商
- 注冊資金：人民幣萬
聯(lián)系我們
聯(lián)系人：楊燕燕
熱門標簽
技術文章
推薦:兔蛋白激酶A1α(PKA1α)ELISA試劑盒
點擊次數(shù)：10 發(fā)布時間：2023/12/27 13:58:21
推薦:兔蛋白激酶A1α(PKA1α)ELISA試劑盒
【原理】
ELISA雙抗體夾心法（enzyme linked immunosorbent assay——sandwich technique）的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，判斷抗原含量。
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被檢測指標抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的指標呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
ELISA （Enzyme-Linkedimmunosorbent assay）的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活力。在測定時，把待測樣本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，所以可根據(jù)顏色反應的深淺定性或定量分析。由于酶的催化速率很高，所以可大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。
酶聯(lián)免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) ：是酶免疫測定技術中應用廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。
推薦:兔蛋白激酶A1α(PKA1α)ELISA試劑盒
推薦:兔蛋白激酶A1α(PKA1α)ELISA試劑盒
簡介
自從Engvall和Perlman(1971）次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA）以來，由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)點，使其得到迅速的發(fā)展和廣泛應用。盡管早期的ELISA由于特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是采用基因工程方法制備包被抗原，采用針對某一抗原表位的單克隆抗體進行阻斷ELISA試驗，都大大提高了ELISA的特異性，加之電腦化程度高的ELISA檢測儀的使用，使ELISA更為簡便實用和標準化，從而使其成為廣泛應用的檢測方法。
如ELISA方法已被廣泛應用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛采用的標準方法。
基本原理
ELISA方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
特性
用于標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應產物易于顯現(xiàn)；能商品化生產。如應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用廣。
辣根過氧化物酶
過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含量高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標記。RZ在2.5以上者方可用于標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：⑴鄰苯二胺（OPD），產物為橙色，可溶性，敏感性高，大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數(shù)小時內不改變,是目國內ELISA中常用的一種；⑵聯(lián)大茴香胺（OD），產物為橘黃色，大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；⑶5－氨基水楊酸(5－AS）：產物為深棕色，大吸收值在449nm，部分溶解，敏感性較差；⑷鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產物為藍色，大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
堿性磷酸酶
系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產物呈黃色，可溶，大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。
標記方法
良好的酶結合物取決于兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶�？贵w的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用于實驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對之透析過夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進行測定后，冷凍干燥或低溫保存。
效果測定
測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
⑴ 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色后，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
⑵ 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計于403nm和280nm進行測定，然后按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對于過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用于ELISA的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果好。mol.比值由于結合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時好。酶結合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時好。
原創(chuàng)作者：上海篤瑪生物科技有限公司
