維生素B6(VB6)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

（本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!）

聲明：尊敬的客戶(hù)，感謝您選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測(cè)血清、血漿或其 它相關(guān)生物液體中天然和重組 維生素B6(VB6) 濃度。使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)并檢查試劑組分！

試劑盒組成：

特別說(shuō)明：

*: [96T/48T]（打開(kāi)包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全完整）

#:  一周內(nèi)使用可存于4℃，需長(zhǎng)時(shí)間存放或多次使用建議存于-20℃.

相關(guān)試劑在分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些，請(qǐng)在使用時(shí)量取而非直接倒出！

檢測(cè)原理: 本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。用維生素B6(VB6)抗原包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的維生素B6(VB6)與包 被的維生素B6(VB6)競(jìng)爭(zhēng)生物素標(biāo)記的抗維生素B6(VB6)單抗上的結(jié)合位點(diǎn)，游離的成分被洗去。加入辣根過(guò)氧化物 酶標(biāo)記的親和素，生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色 底物(TMB)，TMB在辣根過(guò)氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)處測(cè)OD值，維生素B6(VB6)濃度與OD450值之間呈反比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中維生素B6(VB6)的濃度。

樣品收集:

1.   血清：全血樣品于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)ye后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，收集 血液的試管應(yīng)為一次性的無(wú)熱原，無(wú)內(nèi)毒素試管。

2.   血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內(nèi)于1000×g離心15分鐘，取上清即可 檢測(cè)。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.   組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì) 影響測(cè)量結(jié)果），稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體

積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。 推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組 織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。*后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘， 取上清檢測(cè)。

4.   細(xì)胞培養(yǎng)上清：取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè)。

5.   其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè) 具體處理方法可參考：

6.   樣品應(yīng)清澈透明，懸浮物應(yīng)離心去除。

7.   樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍 存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測(cè))，或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融。

8.   如果您的樣品中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品*高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋（建議先 做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù)）。

試驗(yàn)所需自備物品:

1.   酶標(biāo)儀(450nm波長(zhǎng)濾光片)

2.   高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.   37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.   吸水紙

檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:

1.    請(qǐng)?zhí)?span>前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2.    將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié) 晶，屬于正常現(xiàn)象，可用40℃水浴微加熱使結(jié)晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超 過(guò)50℃，使用時(shí)洗滌液應(yīng)為室溫）。當(dāng)日使用

3.    標(biāo)準(zhǔn)品: 于10000×g離心1分鐘，加入標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，旋緊管蓋， 靜置10分鐘，上下顛倒數(shù)次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為600ng/mL）。 然后根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋（注：不要直接在反應(yīng)孔中進(jìn)行倍比稀釋）。

4.    生物素化抗體工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以50μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配

制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作 濃度。當(dāng)日使用。

5.    酶結(jié)合物工作液：實(shí)驗(yàn)前計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需用量（以100μL/孔計(jì)），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制

100-200μL。使用前15分鐘，以酶結(jié)合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結(jié)合物(1:100)成工作濃度。 當(dāng)日使用。

洗滌方法:

1.    自動(dòng)洗板機(jī)：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.    手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸 去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。

操作步驟:

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫；試劑或樣品配制時(shí)，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.    加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔�？�白孔加標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液 50μL，余孔分 別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 50μL，立即每孔加入配好的生物素化抗體工作液 50μL（在使用前

15 分鐘內(nèi)配制），注意不要有氣泡，加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕 晃動(dòng)混勻。給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育 45 分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.    棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL /每孔，甩干并在吸水紙 上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。

3.    每孔加酶結(jié)合物工作液（臨用前 15 分鐘內(nèi)配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。

4.    棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。

5.    每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標(biāo)板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據(jù)實(shí)際顯 se情 況酌情縮短或延長(zhǎng)，但不可超過(guò) 30 分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止）。

6.    每孔加終止液 50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的

加入順序相同。

7.    立即用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD 值）。應(yīng)提前打開(kāi)酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀 器，設(shè)置好檢測(cè)程序。

8.    實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至有效期結(jié)束。

注意事項(xiàng)：

1.   保存：試劑盒中各試劑請(qǐng)按說(shuō)明書(shū)提示合理存放。在儲(chǔ)存及溫育過(guò)程中避免將試劑暴露在強(qiáng) 光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染，否則可能會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤的結(jié)果。

2.   酶標(biāo)板：剛開(kāi)啟的酶標(biāo)板孔中可能會(huì)有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成 任何影響。暫時(shí)不用的板條應(yīng)拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.   加樣：加樣或加試劑時(shí)，個(gè)孔與*后一個(gè)孔的加樣時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。每次的加樣時(shí)間*好控制在

10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔。

4.   溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須給酶標(biāo)板覆膜；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo) 板處于干燥狀態(tài)；嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

5.   洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸

水。在讀數(shù)前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

6.   試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較小， 運(yùn)輸過(guò)程會(huì)使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉(zhuǎn)/分離心1min，以使附著管壁或瓶蓋的 液體沉積到管底。取用前，請(qǐng)用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化抗體工 作液、酶結(jié)合物工作液請(qǐng)根據(jù)所需用量配制，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請(qǐng)精確 配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection Ab時(shí)， 一次不要小于10μL），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成濃度誤差；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo) 準(zhǔn)品、生物素化抗體工作液、酶結(jié)合物工作液。若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分 裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復(fù)凍融。

7.   顯色時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很 明顯，請(qǐng)提前加入終止液終止反應(yīng)，避免顏色過(guò)深影響酶標(biāo)儀讀數(shù)。

8.   底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

9.   混勻：充分輕微混勻?qū)?span>反應(yīng)結(jié)果尤為重要，使用微量振蕩器(使用頻率)，如無(wú)微量 振蕩器，可在反應(yīng)前手工輕輕敲擊酶標(biāo)板框混勻。

10. 安全：試驗(yàn)中請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品 時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。

11. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應(yīng)終止液除外）

12. 試驗(yàn)中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴(yán)禁混用，否則將影響試驗(yàn)結(jié)果！