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豬偽狂犬病毒抗原ELISA檢測(cè)原理
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上傳時(shí)間：2016/6/14 10:06:18
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上 傳 者：勁馬免疫學(xué)第三方檢測(cè)中心
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使用說(shuō)明書(shū) 貨號(hào): SU-A50167
l 本試劑盒用于體外定性檢測(cè)血清、血漿、組織、細(xì)胞上清及相關(guān)液體樣 本中豬偽狂犬病毒抗原（PRV-Ag）。
l 有效期：6個(gè)月
l 保存條件：2-8℃
實(shí)驗(yàn)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被豬偽狂犬病毒抗原
（PRV-Ag）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、陰性和陽(yáng)性對(duì)照、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體， 經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作 用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的豬偽狂犬病毒抗原（PRV-Ag）呈正相關(guān)。用
酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值），判定陰陽(yáng)性。
樣本處理及要求
1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過(guò)夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)， 或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘， 或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃ 或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：標(biāo)本溶血會(huì)影響*后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑和器材
1. 酶標(biāo)儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
4. 蒸餾水或去離子水
試劑盒組成
| 名稱(chēng) | 96 孔配置 | 48 孔配置 | 備注 |
| 微孔酶標(biāo)板 | 12 孔×8 條 | 12 孔×4 條 | 無(wú) |
| 陰性對(duì)照 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 | 無(wú) |
| 陽(yáng)性對(duì)照 | 0.3mL*6 管 | 0.3mL*6 管 |
|
| 檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無(wú) |
| 20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋 |
| 底物 A | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 底物 B | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 終止液 | 6mL | 3mL | 無(wú) |
| 封板膜 | 2 張 | 2 張 | 無(wú) |
| 說(shuō)明書(shū) | 1 份 | 1 份 | 無(wú) |
| 自封袋 | 1 個(gè) | 1 個(gè) | 無(wú) |
注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室 溫 20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過(guò)程中 不要讓微孔干燥掉。
3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。
4. 底物顯色液應(yīng)呈無(wú)色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7. 平衡至室溫后再打開(kāi)密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞 試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9. 不能使用過(guò)期產(chǎn)品。
10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋?zhuān)?span>即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1. 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。
2. 設(shè)置陰性對(duì)照孔、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔，陰性、陽(yáng)新對(duì)照孔各加 50μL 對(duì)照品；
3. 樣本孔中加入待測(cè)樣本 50μL；空白孔不加。
4. 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體
100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。
5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙 上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的 OD 值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
1. 陰性對(duì)照OD值：小于0.2。
2. 陽(yáng)性對(duì)照OD值：大于0.8。
3、陽(yáng)性判斷（Cut-Off值）：陰性對(duì)照OD值+0.15，樣本OD值大于閾值，判定為陽(yáng)性，反之， 為陰性。
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