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2D 電泳細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明

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上傳時(shí)間：2015/7/10 10:23:41

文件類型：jpg

上 傳 者：勁馬免疫學(xué)第三方檢測(cè)中心

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                                                                 2D 電泳細(xì)胞裂解液(總蛋白)

 Store at -20℃ for 12 months

For Research Use Only

 一、 試劑盒說(shuō)明

樣品制備是雙向電泳中*為關(guān)鍵的一步，這一步處理的好壞將直接影響 2D 電泳結(jié)果。 2D 電泳細(xì)胞裂解液（總蛋白）

可以幫助您方便地從動(dòng)物組織和細(xì)胞中提取總蛋白（含可溶性膜蛋白）。

 二、 試劑盒組份

 

組份

含量

儲(chǔ)存溫度

2D 電泳細(xì)胞裂解液（總蛋白）

50 mL

2-8℃

DTT

0.5 mL

-20℃，避光

備注：

1．為取得*佳的使用效果，盡量避免過(guò)多的反復(fù)凍融。建議可適當(dāng)分裝后使用。

2．所有接觸樣品的用具及試劑均需預(yù)冷。裂解蛋白的所有步驟都需在冰浴或 4℃進(jìn)行。

3．可參考凱基產(chǎn)品相關(guān)說(shuō)明（見(jiàn)凱基網(wǎng)站）或通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定適合您實(shí)驗(yàn)條件的*佳裂解液。

4．提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑。

5．為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

6．DTT 在蛋白裂解工作液臨用前 1：100 加入 2D 電泳細(xì)胞裂解液（總蛋白）中，現(xiàn)用現(xiàn)配。

 

 

三、操作步驟

 

Ⅰ 實(shí)體組織蛋白的提取

（1）  采集新鮮組織樣本；

（2）  用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每 100mg 樣品加入 0.4-0.5ml 裂解液工作液中，使用組織勻漿器 勻漿 30s（注意 1）。

（3）  組織懸液 15℃，20 000×g 離心 30 min（注意 2）。

（3）  吸取上清。沉淀用 1/4 體積的步裂解液用量重懸，渦旋劇烈震蕩 30s 后，15℃，20 000×g 離心 30 min。

（4） 合并兩次上清液，吸取少量上清用 Bradford 法定量蛋白，然后分裝至 Eppendof 管里保存在-70℃?zhèn)溆?span>。（注 意 3）

 

 

Ⅱ    培養(yǎng)細(xì)胞蛋白提取

（1）  培養(yǎng)細(xì)胞的收集；

（2）  用磷酸緩沖液（PBS）洗細(xì)胞 3 次（室溫，1000g，各 2min）；

（3）  將細(xì)胞分裝到 1.5ml Eppendof 管中，吸干殘留的 PBS；

（4） 加入裂解緩沖工作液（1.5x106 個(gè)細(xì)胞大約加入 100µL 裂解液），在室溫振蕩 1h，使其充分溶解（注意 1）；

（5）  4oC，40,000g，離心 1h（注意 2）；

（6）吸取上清并用 Bradford 法定量蛋白，然后分裝至 Eppendof 管里保存在-78oC 備用（注意 3）。


四、注意事項(xiàng)

 

1.      核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應(yīng)控制好條件，防止產(chǎn)生泡沫；加入的外源核酸酶則會(huì)出現(xiàn)在*終 的 2D 膠上。

2.      脂類和多糖都可以通過(guò)超速離心除去。

3.      透析可以降低鹽濃度，也可以采取凝膠過(guò)濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會(huì)造成蛋白質(zhì)的部分損失。

 

 

 

 

 

 

 

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