國達黃曲霉毒素免疫親和柱您的食品安全專家

1、方法簡介：

本方法是用免疫親和柱凈化，高效液相色譜熒光法檢測黃曲霉毒素 B1，B2，G1 , G2，M1和M2，此法可適用于果仁及其類似物，干水果，谷物，調(diào)味品，茶葉，咖啡，可可，及其他食品原料和飼料。

黃曲霉毒素易溶于極性的有機試劑，因此均勻基質(zhì)中的黃曲霉利用甲醇/水通過搖晃或分散提取而得，對于高脂肪/油含量的樣品基質(zhì)需加入正己烷予以脫脂。然后過濾 PBS稀釋。但對于飼料，調(diào)味品，茶葉，咖啡，可可等不用PBS而用吐溫溶液稀釋然后經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，然后經(jīng) HPLC柱后光化學(xué)衍生熒光檢測器檢測。

2、提取步驟：

儀器，所需試劑，溶劑

黃曲霉毒素免疫親和柱系列：免疫親和柱系列  （1ml，25支/盒；3ml，15支/盒）；

高效液相裝置：安捷倫  1200 系列 含泵，在線脫氣機，自動進樣器，熒光檢測器，柱溫箱；

光化學(xué)反應(yīng)器：Photochemical   Reactor 另帶反應(yīng)圈和 UV燈；

色譜柱：XB-C18   5µm, 250 x 4.6 mm；

預(yù)柱：C18 4 x 2 mm；均質(zhì)機；水平振蕩器；攪碎機；濾紙；漏斗；錐形瓶：100 ml；玻璃纖維過濾器；SPE轉(zhuǎn)接頭及  50ml大容量上樣器   SPE Adapter10 ml一次性注射器；

分析天平（精度 0.02 g）；1.8 mL自動進樣樣品瓶；移液槍；SPE裝置帶抽真空系統(tǒng)：SPE  Device

黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2,M1,M2混標(biāo)或需測單標(biāo)；吐溫  20；

PBS緩沖溶液：1.16 g  Na2HPO4/0.20 g  KH2PO4/ 8  g NaCl/0.2  g KCl  溶于

900ml水中，用HCL或NaOH調(diào)PH至7.4然后定容至1000ml；

磷酸氫二鈉；磷酸二氫鉀；氯化鉀；氯化鈉；去離子水；甲醇，分析純；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；正己烷，分析純；

提取溶液：甲醇和水體積比80/20，對于泥漿樣純甲醇（分析純）作為提取溶劑單獨使用；HPLC

洗脫液A：水。

洗脫液B：甲醇/乙腈80/20 （v/v）。

吐溫溶液：100ml吐溫20溶于900ml水中

HPLC校正標(biāo)準(zhǔn)溶液：

由標(biāo)準(zhǔn)溶液配成目標(biāo)物含量為1ug/kg的校正溶液前處理步驟：

花生果仁類似產(chǎn)品的提取（開心果，杏仁，杏仁殼，花生及其類似物）：稱取50g漿狀樣（均質(zhì)時加入100-300%水）加入5gNaCl（對于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），加入75ml純甲醇然后均質(zhì)3分鐘或震蕩提取30分鐘。對于量少的樣品，稱25g干燥的均勻樣，加入5g NaCl和100ml甲醇/水80/20 （v/v） 溶液，然后均質(zhì)3分鐘或震蕩30分鐘進行提取。將提取液用濾紙過濾或離心，上清液轉(zhuǎn)移于100ml錐形瓶中。

對于特殊的花生醬或其他果仁醬，其外面有一層油脂，所以很難被提取。稱25g樣品，加入  5g NaCl，100ml提取溶液和50ml正己烷。用均質(zhì)機提取3-5分鐘，油脂部分會溶于正己烷相，過濾收集澄清液。

谷物牛奶類稱取 ：

25g樣于250ml錐形瓶中，加入5g NaCl，100ml提取溶液（對于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），然后在水平震蕩器上150 rpm震蕩30分鐘。對于奶粉樣品可稱取2-5g加提取液溶解，如難溶解可適當(dāng)加熱，濾紙過濾，收集澄清液。

調(diào)味品，茶，咖啡，可可，飼料，醫(yī)藥品，辣椒提取物

稱取20g干樣，50g泥漿樣，加入5g NaCl，100ml提取溶液，漿狀樣加80ml純甲醇（對于加標(biāo)樣品加入加標(biāo)溶液），然后在水平震蕩器上150rpm震蕩30分鐘。濾紙過濾，收集澄清液。取5ml濾液加入20ml吐溫溶液稀釋，稀釋液用玻璃纖維過濾器過濾。

空白值：

試劑空白值必須測定。

免疫親和柱（IAC）凈化

將免疫親和柱置于固相萃取裝置上，一個樣品對應(yīng)一根柱子；10ml PBS溶液活化柱子，流速保持在2–3 ml/min，確保上樣前柱子保留少量（0.5ml）的 PBS溶液，活化液不收集；

1、花生，果仁類似物及谷物牛奶的提取液：3.1ml提取液用9.9mlPBS稀釋。用12.6ml稀釋液通過IAC，但流速不能超過5 mL/min。用約20ml去離子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超過5 mL/min，抽真空1分鐘；

2、調(diào)味品，茶，咖啡，可可，飼料，醫(yī)藥品，辣椒提取物：9ml稀釋樣品通過免疫親和柱，流速不超過 5 mL/min。用約20ml去離子水淋洗柱子，其中10ml流速不得超過5 mL/min，抽真空1分鐘；

用1.5ml甲醇洗脫；

（將柱子接于玻璃裝置上，用0.75ml甲醇兩次將目標(biāo)物洗脫下來并收集于15ml 離心管中，起始在柱子上加壓令其大概通過4滴液滴，然后利用重力讓其自然流下，*后通入空氣令液體全部流出并收集。）

洗脫液用1.5ml水稀釋并混勻,*終體積為3ml；過濾后上機測試

注：具體免疫親和柱使用方法可參考說明書

3. 液相色譜-熒光測定

儀器

液相色譜系統(tǒng)：

Agilent 1200二元高壓泵

Agilent 1200真空脫氣機

Agilent 1200恒溫自動進樣器

Agilent 1200柱溫箱

光化學(xué)柱后衍生裝置

色譜柱：XB-C18    250mm x 4.6 mm 5um

預(yù)柱：C18，4 x52µmmm

流動相：（乙腈：甲醇（50:50））：水=35:65

進樣體積：20ul

流速：1 ml/min

柱溫：35 °C

熒光檢測器：激發(fā)：365nm；發(fā)射：450nm

激發(fā)：365nm；發(fā)射：450nm

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