目的建立檢測sPTA1的方法，探討正常人和腫瘤患者血清中是否存在可溶性PTA1分子。方法以親和層析法從血小板純化的天然PTA1分子作為免疫原，制備抗PTA1分子的多克隆抗體，并以此建立檢測sPTA1的雙抗體夾心ELISA法。結(jié)果建立的雙抗體夾心ELISA法敏感性達100ng/L，應(yīng)用此方法從經(jīng)TPA，PHA及抗CD3mAb活化的人PBMC細胞培養(yǎng)上清中檢測到sPTA1。與膜型PTA1分子表達的動態(tài)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，sPTA1的產(chǎn)生晚于mPTA1分子的表達，且可持續(xù)存在。檢測60例正常人血清sPTA1的水平為μg/L，16例腫瘤患者為μg/L。血清中sPTA1相對分子質(zhì)量約為50000。結(jié)論首次發(fā)現(xiàn)sPTA1分子，建立了具有較高敏感性和特異性的檢測sPTA1的方法，為進一步深入研究PTA1分子的生物學(xué)功能提供了新的手段。

關(guān)鍵詞：夾心ELISA；PTA1；可溶性粘附分子

許多免疫細胞膜分子存在膜型和可溶性兩種形式。某些可溶性形式的分子對于其膜型分子功能的發(fā)揮和調(diào)節(jié)，以及對一些疾

病的發(fā)生、診斷及預(yù)后判定具有重要的意義。血小板/T細胞活化抗原1是免疫細胞膜上一種新的分子［1］。1997年基因克隆成功［2］，主要分布于活化T細胞、NK細胞、巨核/血小板譜系及內(nèi)皮細胞。PTA1分子參與殺傷性T細胞的分化、血小板的活化與凝集［2，3］，是一種刺激型NK細胞受體［2］。臨床初步研究表明，PTA1分子與血小板功能異常、自身免疫性疾病、病毒感染性疾病、腫瘤及移植物抗宿主病等的發(fā)病關(guān)系密切［4，5］。我們首次證實，細胞培養(yǎng)上清和人血清中存在可溶性PTA1分子，并討論了其生理意義及與臨床疾病的關(guān)系。

1材料和方法

1.1材料新西蘭純種兔由本校動物中心提供。PMSF，碘乙酰胺，胰蛋白酶抑制劑，PHA，TPA，ABTS和FITC標(biāo)記的抗鼠抗體，均為Sigma公司產(chǎn)品。Sepharose4B購自Pharmaia公司，WesternBot試劑盒為BoheringerMannheim公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體購自博士德公司�？笴D3mAb、抗PTA1mAbLeoA1和FITC標(biāo)記的抗兔抗體為本室制備。ELISA板為Nun公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1PTA1的純化及其Mr的測定離心收集人血小板置裂解緩沖液中，其組成為1

0mmo/LTris�睭C，1％NP��40，150mmo/LNaC，2mmo/LPMSF，20mmo/L碘乙酰胺，10mg/L胰蛋白酶抑制劑及1g/LBSA。于4℃緩慢攪拌1h后，以27000g離心15min，除去不溶性物質(zhì)［3］。親和層析方法依照Pharmaia公司Sepharose4B操作說明書進行。以不同稀釋度經(jīng)LeoA1�睸epharose4B親和層析柱純化的PTA1分子包被ELISA板，用間接ELISA法檢測其免疫反應(yīng)性。純化PTA1分子的相對分子質(zhì)量的鑒定：純化的PTA1分子進行SDS�睵AGE，轉(zhuǎn)移PVDF膜，封閉后，與抗PTA1分子的多抗及對照多抗1F12進行反應(yīng)，余按照BoheringerMannheim公司W(wǎng)esternbot試劑盒說明書進行操作。

1.2.2sPTA1檢測方法的建立選取雄性新西蘭純種兔，按照常規(guī)方法制備兔抗PTA1的PAb，建立檢測sPTA1的夾心ELISA法。主要步驟為：以不同濃度的mAbLeoA1包被ELISA板，依次加入不同濃度的PTA1/Ig融合蛋白，然后分別加兔抗PTA1抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，每步驟間均經(jīng)溫育和洗滌，用ABTS底物顯色后，測波長410nm處光吸收值。同時設(shè)立空白、正常兔血清對照及包被無關(guān)mAb1F12的對照。對建立的方法，按常規(guī)進行批內(nèi)、批間穩(wěn)定性實驗。

1.2.3PTA1的檢測分離人PBMC，調(diào)整細胞濃度至5×109/L，以終濃度為20mg/L的抗CD3mAb，5mg/L的PHA或50μg/L的TPA分別活化人PBMC。于不同時間點收集細胞培養(yǎng)上清檢測sPTA1，同時收集細胞，按

照常規(guī)進行間接免疫熒光染色�？笴D3mAb刺激細胞采用兔抗PTA1PAb，PHA和TPA刺激細胞采用mAbLeoA1，分別與活化的PBMC反應(yīng)，洗滌后加FITC標(biāo)記的抗兔或抗鼠抗體與細胞反應(yīng)，*后用流式細胞儀檢測mPTA1分子的表達。收集正常人血清、腫瘤患者血清以及細胞培養(yǎng)上清，用上述建立的夾心ELISA方法檢測sPTA1。

1.2.4sPTA1Mr的測定取正常人血清，用mAbLeoA1或?qū)φ湛贵w1F12做免疫沉淀后，再以抗PTA1PAb進行Westernbot測定sPTA1的Mr。

2結(jié)果

2.1純化PTA1分子及其多克隆抗體的鑒定純化的天然PTA1分子保持了較好的免疫反應(yīng)性，與無關(guān)抗體未出現(xiàn)交叉反應(yīng)。Westernbot結(jié)果表明，純化PTA1僅出現(xiàn)1條帶，其Mr約為67000。ELISA檢測結(jié)果表明，免疫兔產(chǎn)生的抗PTA1分子PAb與其它蛋白無交叉反應(yīng)，抗體效價為2.5×10-7。