引言

沙棘(H ipp op hae rham noid es L. ) 是胡頹子科沙棘屬的灌木亞喬木, 沙棘葉中富含黃酮類化合物�？傸S酮的提取主要有水浸提法、堿水浸提法以及溶劑回流提取法[ 1～ 3 ] , 這些方法操作繁瑣、提取率低。超聲波可以使提取介質(zhì)中的微小氣泡縮、爆裂, 破碎原料的細胞壁, 加速有效成分的溶出、擴散, 可大大縮短提取時間, 提高提取效率。超聲技術(shù)作為一種有效的提取方法, 已經(jīng)應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取研究中[ 4～ 6 ]。而超聲循環(huán)技術(shù)是在料液循環(huán)流動的過程中施加超聲波, 是一種提取天然產(chǎn)物的新技術(shù)。

1　材料與方法

1．1　原料與試劑

沙棘葉采自山西省陽高縣; 蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所) ; 乙醇(95% )、石油醚(沸程60～ 90℃)、乙酸乙酯、丙酮、結(jié)晶氯化鋁、氫氧化鈉(北京化工廠) 均為分析純。

1．2　主要儀器與設(shè)備

HF-2.5B 型超聲循環(huán)提取機(北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司) , 用于超聲循環(huán)提取; SK250H 型超聲清洗儀(上�？茖�(dǎo)超聲儀器有限公司) , 用于普通超聲提取; 101-2 型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海滬南科學(xué)儀器聯(lián)營廠) , 用于干燥原料; LD-02 型二兩裝高速中藥粉碎機(溫嶺市大海藥材器械廠) , 用于粉碎樣品; 分樣篩(上虞市沙篩廠) , 用于篩分一定目次的沙棘葉粉末; Sarto riou s 電子分析天平(德國) , 用于精密稱量; 索氏提取器(北京玻璃儀器廠) , 用于回流提取; 752 型紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司) , 用于測定提取液的吸光度值; TU 1901 型紫外雙光束分光光度計(北京普析通用有限責任公司) , 用于全波段掃描的分析。PHS-25 型pH 計(上海精科雷磁公司) , 用于調(diào)節(jié)提取液的pH 值。

1．3　試驗方法

1．3．1　原料預(yù)處理

將沙棘葉經(jīng)過挑選、整理、去刺, 在110℃下烘烤至干, 留下一部分測定其含水率, 其余經(jīng)粉碎后過40 目篩; 用石油醚回流除去油脂、色素等雜質(zhì), 由于石油醚是油溶性物質(zhì)的良好溶劑, 所以用石油醚可以提取油脂、色素等低極性物質(zhì), 起到除雜的作用, 以免影響黃酮的提取與測定。揮干石油醚后即為沙棘葉粉末。

1．3．2　標準曲線的制作

精確稱量蘆丁標準品5.0 m g, 用95% 的乙醇定容至50 mL 容量瓶中, 分別取0 mL、0.5 mL、
1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL 于5 mL 容量瓶中, 各加入1% 的A lCl3 溶液(溶劑為95% 乙醇) 0.5 mL , 用95% 的乙醇定容至刻度, 放置10 m in, 于430 nm 下測定其吸光度。得出線性回歸方程為: A = 25.971C+ 0.0044, 式中A 為吸光度, C 為測定液質(zhì)量濃度(g/L) , 相關(guān)系數(shù)r= 0.999 9。

1．3．3　提取方法

(1) 索氏提取法
準確稱取沙棘葉粉末5.000 g, 用濾紙包好, 置于索氏提取器中, 加入提取溶劑80 mL 回流提取黃酮, 至提取液接近無色。將提取液濃縮至干, 即得總黃酮粗品。

(2) 超聲提取方法
準確稱取沙棘葉粉末5.000 g, 于250 mL 具塞三角瓶中, 加入提取溶劑, 放入超聲波清洗儀中, 超聲提取30 m in, 將提取液經(jīng)過濾后濃縮至干, 即得總黃酮粗品。

(3) 超聲循環(huán)提取法
將處理過的樣品用超聲波循環(huán)裝置進行提取, 參數(shù)設(shè)定為: 功率1 kW , 轉(zhuǎn)速1 200 r.min, 超聲波工作3.5 s、間隔0.3 s。提取液經(jīng)過濾后濃縮至干, 即得總黃酮粗品。

1.3.4　總黃酮測定及計算
將總黃酮粗品溶解于95% 乙醇中, 加入1% A lCl3 乙醇溶液, 定容至一定體積, 以蘆丁為標準品, 利用分光光度法測定總黃酮提取率。

2　結(jié)果與討論

2.1　*佳檢測波長的確定
取適量蘆丁標準品溶解于95% 乙醇中, A lCl3 顯色, 用TU 1901 型紫外雙光束分光光度計在K為190～ 500 nm 范圍內(nèi)進行雙光束紫外光譜掃描, 確定其*佳吸收波長, 如圖1。由圖1 可見, 蘆丁的95% 乙醇溶液在A lCl3 顯色的作用下, 在430 nm 處有吸收峰, 確定為*佳測定波長。

　2.2　提取溶劑的選擇
文獻[7 ]報道, 黃酮苷類和極性較大的苷元, 一般可用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮等提取。水雖然是廉價、易得、清潔的溶劑, 但是考慮到用水提取, 提取液中雜質(zhì)較多, 還常含有粘液, 濃縮時會產(chǎn)生泡沫, 給進一步分離帶來很多困難, 增加了成本, 且提取物容易發(fā)霉、發(fā)酵, 因此決定不采用水作為提取劑。甲醇雖然有毒, 但文獻[8～ 9 ]報道, 甲醇及其溶液提取效果好, 因此本試驗分別選擇95% 乙醇、無水甲醇、乙酸乙酯、丙酮為提取劑, 進行索氏提取, 至提取液接近無色, 結(jié)果見表1。

              表1　不同提取劑的提取率
   提取溶劑   95%乙醇  無水甲醇  乙酸乙酯   丙酮
   提取率/%   1.958     2.112      0.571     0.696

由表1 可以看出, 無水甲醇提取率, 乙醇與無水甲醇提取效果相當, 乙酸乙酯與丙酮提取率。這是由于黃酮類化合物極性較大, 甲醇和乙醇以及相應(yīng)的水溶液極性較大, 所以提取率較高; 而乙酸乙酯和丙酮相比極性較小, 相對而言提取率較低。甲醇毒性較大, 相對而言乙醇毒性小、本身有殺菌作用, 不易發(fā)霉變質(zhì), 所以*后選擇乙醇為沙棘葉黃酮的提取劑。

2.3　索氏提取的提取率確定

優(yōu)化沙棘葉中總黃酮的提取條件, 設(shè)計三因素三水平正交試驗, 影響因素為乙醇的體積分數(shù)、提取劑的pH 值、提取時間, 其因素水平表見表2, 結(jié)果見表3。

          表2　正交試驗因素水平表
水平             因素
       乙醇的體積分數(shù)A /%  pH 值B           時間C/h
1                65          8.0               4
2                75          9.0               5
3                85          10.0              6

       表3　正交試驗結(jié)果表
試驗號     A          B         C      提取率/%
1          1          1     1       1.358
2          1          2     2       1.485
3          1          3     3       1.862
4          2          1     2       1.604
5          2          2     3       1.978
6          2          3     1       1.600
7          3          1     3       1.146
8          3          2     1       1.034
9          3          3     2       1.130
Ⅰ        4.705     4.108   3.992
Ⅱ        5.182     4.497   4.219
Ⅲ         3.310    4.592   4.986
R         0.624 0   0.161 3  0.331 3

由表3 可知, 各個因素的影響順序是A 、C、B , 較佳組合為A 2B 2C3, 即以75% 的乙醇為提取劑、pH 值為9.0、時間為6 h, 可以得到較好的效果, 提取率達到1.978%。

2.4　超聲提取試驗

2.4.1　料液比和pH 值的確定

用普通超聲提取法對料液比和pH 值進行初探, 對料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 進行試驗, 其提取率分別為1.091%、1.372%、1.432%、1.472% , 可見料液比對黃酮的提取率有一定的影響, 隨著料液比的降低提取率升高, 在1∶25 之后變化很小。而且考慮到料液比太高循環(huán)會有一定的困難, 從而影響提取率, 料液比太低會增加溶劑的用量, *后選擇料液比為1∶25。對溶劑pH 值6.0、7.0、8.0、9.0 進行試驗, 提取率分別為1.432%、1.444%、1.454%、1.468% , 可見提取溶劑的pH 值對超聲提取的提取率影響不大, 這是由于超聲破碎作用的影響掩蓋了pH 值的影響。所以選擇溶劑在固定的pH 值下進行提取, 經(jīng)測定75% 乙醇的pH 值為7.4, 這是與索氏提取的一個不同之處。

2.4.2　乙醇體積分數(shù)和超聲時間對提取率的影響

　超聲循環(huán)提取法提取沙棘葉中總黃酮, 乙醇的體積分數(shù)對提取率影響很大, 75% 的乙醇提取率, 其次是50% 的乙醇, 乙醇的體積分數(shù)較高或者較低, 提取率均不佳。對于同一體積分數(shù)的乙醇, 隨著提取時間的增加, 提取率升高, 但是達到一定程度后提取率反而隨著時間的增加而降低。這是由于隨著超聲時間的增加, 某些黃酮類化合物受到了破壞的緣故。*后選擇超聲循環(huán)提取的溶劑體積分數(shù)為75% , 提取時間為20 m in。

2.5　超聲循環(huán)提取法與普通超聲提取法、索氏提取法的對比

將超聲循環(huán)提取法與普通超聲提取法、索氏提取法相比較, 結(jié)果見表4。


        提取方法                提取參數(shù)                        提取率/%
            乙醇體積分數(shù)/%  pH 值  提取時間/min   
超聲循環(huán)提取法        75          7.4      10/20/30     1.919/2.144/2.194
普通超聲提取法        75          7.4      30           1.432
索氏提取法            75          9.0      360          1.978

由表4 可見, 利用超聲循環(huán)提取法, 提高了沙棘葉中總黃酮的提取效率, 用75% 的乙醇進行沙棘葉中總黃酮的提取, 超聲提取10m in 即與索氏提取6 h 的提取效果相當, 同時遠高于普通超聲提取。超聲循環(huán)提取采用物料循環(huán)、超聲場固定分布、物料在超聲場中順序移動的技術(shù), 達到快速提取的目的, 提取效率較普通超聲提取有很大的提高。



3　結(jié)束語

75% 乙醇用于不同提取方法中提取沙棘葉中總黃酮, 均為溶劑的*佳體積分數(shù)。超聲循環(huán)提取的效果明顯優(yōu)于普通超聲提取與索氏提取。超聲提取與索氏提取相比, 節(jié)約了時間和能耗, 且提取工作在室溫下進行, 可避免高溫對提取成分的影響。超聲循環(huán)提取在沙棘葉總黃酮的提取中具有明顯的優(yōu)勢, 是一種具有發(fā)展前景的天然產(chǎn)物提取技術(shù)。

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