【GB/T 4789.10?1994】
食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)　金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)

　　1　主題內(nèi)容與適用范圍
　　本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)方法。
　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。
　　2　引用標(biāo)準(zhǔn)
　　GB 4789.28　食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑
　　3　設(shè)備和材料
　　3.1　顯微鏡。
　　3.2　溫箱：36±1℃。
　　3.3　離心機(jī)。
　　3.4　滅菌吸管：1mL、10mL。
　　3.5　滅菌試管。
　　3.6　滅菌平皿。
　　3.7　均質(zhì)器。
　　3.8　載玻片。
　　3.9　L型涂布棒。
　　3.10　酒精燈。
　　3.11　接種環(huán)。
　　4　培養(yǎng)基和試劑
　　4.1　胰酪陳大豆肉湯：按GB 4789.28中4.59規(guī)定。
　　4.2　7.5%氯化鈉肉湯：按GB 4789.28中4.61規(guī)定。
　　4.3　血瓊脂平板：按GB 4789.28中4.6規(guī)定。
　　4.4　Baird－Prker瓊脂平板：按GB 4789.28中4.60規(guī)定。
　　4.5　肉浸液肉湯：按GB 4789.28中4.1規(guī)定。
　　4.6　滅菌鹽水。
　　4.7　兔血漿：按GB 4789.28中4.63規(guī)定。
　　5　檢驗(yàn)程序
　　金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)程序如下：
　�。▓D略）
　　6　操作步驟
　　6.1　增菌培養(yǎng)法
　　6.1.1　檢樣處理
　　稱取25g固體樣品；吸取25mL液體樣品，加入225mL滅菌生理鹽水，固體樣品研磨或置均質(zhì)器中制成混懸液。
　　6.1.2　增菌及分離培養(yǎng)
　　吸取5mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪陳大豆肉湯50mL培養(yǎng)基內(nèi)，置36±1℃溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird－Parker平板，36±1℃培養(yǎng)24h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。
　　6.1.3　形態(tài)
　　本菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌，排列是葡萄球狀，無(wú)芽胞，無(wú)莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，直徑約為0.5～1μm。
　　6.1.4　在肉湯中呈混濁生長(zhǎng)，在胰酪陳大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長(zhǎng)，血平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird－Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤(rùn)、直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹(shù)膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無(wú)混濁帶及透明圈。長(zhǎng)期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落比典型菌落所產(chǎn)生的黑色較淡些，外觀可能粗糙并干燥。
　　6.1.5　血漿凝固酶試驗(yàn)
　　吸取1∶4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，放36±1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)以已知陽(yáng)性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。
　　6.2　直接計(jì)數(shù)方法
　　6.2.1　吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊Baird－Parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1℃溫箱培養(yǎng)。
　　6.2.2　在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±1℃24h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。
　　6.2.3　菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽(yáng)性數(shù)，除以5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。
　　
　　　　　　　　　　　　　　　　附錄A
　　　　　　　　　　　　葡萄球菌腸毒素檢驗(yàn)
　　　　　　　　　　　　　　　（參考件）

　　A1　設(shè)備和材料
　　A1.1　均質(zhì)器。
　　A1.2　冰箱。
　　A1.3　離心機(jī)。
　　A1.4　分液漏斗。
　　A1.5　透析袋。
　　A1.6　振蕩培養(yǎng)箱或普通溫箱：36±1℃。
　　A1.7　滅菌吸管：1mL、10mL。
　　A1.8　電線。
　　A1.9　載玻片。
　　A1.10　三角瓶：250mL。
　　A1.11　直徑150mm大平皿（或帶蓋搪瓷盤）。
　　A1.12　玻璃紙。
　　A1.13　鑷子。
　　A1.14　三角棒。
　　A1.15　直徑2.5mm打孔器。
　　A1.16　有機(jī)玻璃模板。
　　A1.17　橡皮圈。
　　A1.18　細(xì)滴管。
　　A1.19　層析柱：40mm×20～25mm。
　　A1.20　酶標(biāo)測(cè)定器。
　　A1.21　洗瓶。
　　A1.22　微量加樣器：200mL、50mL。
　　A2　培養(yǎng)基和試劑
　　A2.1　腸毒素產(chǎn)毒培養(yǎng)基：按GB 4789.28中4.87規(guī)定。
　　A2.2　營(yíng)養(yǎng)瓊脂。
　　A2.3　1%瓊脂糖（0.9%生理鹽水配制）溶液。
　　A2.4　0.2mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液。
　　A2.5　三氯甲烷。
　　A2.6　6mol/L鹽酸溶液。
　　A2.7　5mol/L氫氧化鈉。
　　A2.8　生理鹽水。
　　A2.9　1%乙酸溶液。
　　A2.10　0.1%噻嗪紅R或氨基黑B。
　　A2.11　硅膠或凡士林。
　　A2.12　A、B、C、D型葡萄球菌腸毒素和抗血清。
　　A2.13　羧甲基纖維素（CM22或CM11 Whatman）。
　　A2.14　0.008mol/L pH5.6磷酸鹽緩沖液。
　　A2.15　0.008mol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液。
　　A2.16　酶標(biāo)記A、B、C、D腸毒素抗血清或酶聯(lián)免疫試劑盒。
　　A2.17　0.1mol/L pH9.5碳酸鹽緩沖液。
　　A2.18　0.05%0.02mol/L pH7.2吐溫－20緩沖液。
　　A2.19　鄰苯二胺酶底物。
　　A2.20　2 mol/L硫酸。
　　A3　檢驗(yàn)程序
　　A3.1　從菌株中檢測(cè)腸毒素
　　從菌株中檢測(cè)腸毒素程序見(jiàn)圖A1：
　�。▓D略）
　　A3.2　從食物檢樣中提取和檢測(cè)腸毒素
　　A3.2.1　微玻片法檢測(cè)腸毒素（濃縮法層析法）程序見(jiàn)圖A2：
　�。▓D略）
　　A3.2.2　酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腸毒素程序見(jiàn)圖A3：
　　（圖略）
　　A4　腸毒素檢測(cè)
　　A4.1　從菌株中提取腸毒素方法
　　A4.1.1　液體透析培養(yǎng)法：用寬2.5cm、長(zhǎng)80cm的透析袋裝入60mL產(chǎn)毒培養(yǎng)基，兩端扎緊，將透析袋裝入250mL三角瓶?jī)?nèi)，加入15mL滅菌生理鹽水，透析袋兩端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高壓滅菌30min，待測(cè)的菌株接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面（試管18mm×180mm），37C培養(yǎng)24h，用生理鹽水5mL，洗下菌落，傾入上述培養(yǎng)瓶中，每個(gè)菌種種一瓶，37℃振蕩培養(yǎng)48h，振速為100次/min。吸出菌液離心，8000r/min
30min，取上清液做雙相瓊脂擴(kuò)散，如為陰性，再裝入透析袋內(nèi)，用電風(fēng)扇吹，或用多聚乙二醇，濃縮至1～2mL，再做瓊脂擴(kuò)散。
　　A4.1.2　固體透析培養(yǎng)法：向直徑150mm的滅菌平皿或帶蓋搪瓷盤中傾入滅菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基約100～120mL，凝固后表面鋪一滅菌玻璃紙，待測(cè)菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h，用約3mL滅菌鹽水洗下菌苔，傾在玻璃紙上，用滅菌三角棒涂滿平皿，37℃培養(yǎng)48h，加入10～20mL滅菌生理鹽水，用滅菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液離心，以下步驟同液體透析培養(yǎng)法。
　　A4.2　從食品中提取腸毒素方法
　　A4.2.1　直接濃縮法：取食品樣品100g，加入無(wú)菌0.2mo1/L
pH7.5磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)成勻漿，置4℃浸泡18～24h，用紗布過(guò)濾將濾液離心8000r/min20min，取上清液，放入分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振搖10min，靜置，將底層三氯甲烷棄去（如不分層，可8000r/min離心20min）。加入6mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至4.5，8000r/min離心20min，取上液，加5mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)pH至7.5，離心取上清液，裝入透析袋或玻璃紙，用電扇吹干，或放多聚乙二醇上濃縮至1～2mL，做微玻片雙向瓊脂擴(kuò)散。
　　A4.2.2　層析法：如需提取較純腸毒素，可將上述濃縮液用蒸餾水洗下，裝入透析袋，以0.008mol/LpH5.6磷酸鹽緩沖液平衡，加入CM層析柱內(nèi)，流速1～2mL/min，用0.008mol/L
pH5.6磷酸鹽緩沖液洗脫，再用0.2mol/LpH6.8磷酸鹽緩沖液洗脫出腸毒素。洗脫液裝入透析袋內(nèi)，用電扇或多聚乙二醇濃縮至1mL，做微玻片雙向瓊脂擴(kuò)散，檢測(cè)腸毒素。
　　A4.3　雙向瓊脂擴(kuò)散檢測(cè)腸毒素
　　A4.3.1　微玻片法：將在95%乙醇中浸泡的載片用潔凈紗布擦干，吸取溶化的0.2%瓊脂糖（蒸餾水配制）滴在載玻片上，使剩余的瓊脂糖流下，放無(wú)塵的環(huán)境中干燥，先將一層薄塑料板放在載玻片上，然后將帶孔的有機(jī)玻璃模板邊緣涂一層薄的硅膠或凡士林，放在塑料板上，兩邊用橡皮圈系緊固定，吸取1%瓊脂糖，立即從模板中間孔加入載玻片和模板之間，直至充滿瓊脂糖，凝固后再將孔中瓊脂糖用注射器針頭挑去，在中間孔滴加抗血清，四周滴加菌株產(chǎn)毒液或食品提取液，放入加有濕棉球的容器內(nèi)，放25～30℃18～24h觀察結(jié)果。可在燈光上，并對(duì)著暗的背景觀察，在抗血清和提取液之間呈現(xiàn)明顯沉淀線。如沉淀線只能微弱可見(jiàn)時(shí)，可進(jìn)行染色。
　　A4.3.2　玻片法：吸取溶化的1%瓊脂糖2.5mL，鋪在潔凈載玻片上，凝固后用直徑2.5mm的金屬打孔器打成幅射型，孔距為2.5mm，中心孔加入腸毒素抗血清，周圍六個(gè)孔加入菌株或食品的腸毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化鈉濕棉球的容器內(nèi)，以保持濕度。置25～30℃18～20h，觀察結(jié)果，在抗血清的提取物之間有明顯沉淀線即為陽(yáng)性。
　　A4.3.3　染色法：用微玻片法取下膠帶和有機(jī)玻璃模板，玻片法可直接將玻片放入蒸餾水中浸泡4～8h，中間換2～3次水，在下述各液中浸10min，10%乙酸中含1%噻嗪紅R（或氨基黑）；1%乙酸；1%乙酸含1%甘油，如脫色不凈，可繼續(xù)浸泡。取出后蓋一濾紙，吸去多余液體，在室溫或35℃烘干。陽(yáng)性者沉淀被染料顏色，可長(zhǎng)期保存。
　�。▓D略 ）
　　A4.4　酶聯(lián)免疫法檢測(cè)腸毒素（雙抗體法）
　　A4.4.1　包被抗體：用0.1mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液稀釋腸毒素抗血清使成5μg/mL，加入洗凈的苯乙烯凹孔板內(nèi)，每孔0.2mL，置36±1℃30min，棄去上液。
　　A4.4.2　洗滌：用0.05%0.02mol/LpH7.2吐溫－20緩沖液洗滌5次。
　　A4.4.3　加入檢樣：如為液體，可直接加入0.2mL，固體樣品取100g，加入0.2mol/LpH7.5磷酸鹽緩沖液100mL，均質(zhì)后取過(guò)濾液0.2mL。
　　A4.4.4　洗滌：同A4.4.2。
　　A4.4.5　每孔內(nèi)加入酶抗體0.2mL，置36±1℃30min，同時(shí)做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。棄去上液。
　　A4.4.6　洗滌：同A4.4.2。
　　A4.4.7　每孔內(nèi)加入鄰苯二胺酶底物溶液0.2mL，室溫放置30min。
　　A4.4.8　每孔內(nèi)加入2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶標(biāo)儀比色。
　　A4.4.9　結(jié)果判定：樣品OD值比陰性對(duì)照，比值大于2為陽(yáng)性，小于2為陰性。
　　附加說(shuō)明：
　　本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司提出。
　　本標(biāo)準(zhǔn)由北京市衛(wèi)生防疫站負(fù)責(zé)起草。
　　本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人劉以賢。
　　本標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部委托技術(shù)歸口單位衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)解釋。

原創(chuàng)作者：湘儀離心機(jī)儀器有限公司