試劑盒采用雙抗原一-步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 。往預先包被病毒性腹瀉病毒抗ti的包被微孔中，依次加入標本、HRP標記的檢測抗原，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在suan的作用下轉化成終的黃色。用酶標儀在450NM波長下測定吸光度(OD值) ，與CUTOFF值相比較，從而判定標本中豬病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的存在與否。

樣品收集、處理及保存方法

1.血清:使用不含熱原和內毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.血漿: EDTA、檸檬suan鹽或肝素抗凝。3000轉離心30分鐘取上清。

3.細胞上清液: 3000轉離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉 離心10分鐘取上清。

5.保存:如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20°C， 避免反

復凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1.酶標儀(450NM)

2.高精度加樣器及槍頭: 0.5-10UL、 2-20UL、 20-200UL、 200-1000UL

3.37℃恒溫箱

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8°C，使用室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶，這屬于正�，F(xiàn)象，水浴加熱使結晶完全溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應立即放回自封袋中，密封(低溫干燥)保存。

3.預處理后的樣本請按照操作步驟用樣本稀釋液適當稀釋以達到試劑盒的的jia檢測效果。.

4.嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。

5.所有液體組分使用充分搖勻。

使用方法：

1. 夾心法：

夾心法常用于檢測大分子抗原，一般的操作步驟為:

a. 將具有一性的抗ti固著（coating）于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的抗原，則其會與塑膠孔盤上的抗ti進行一性鍵結

c. 洗去多余待測檢體，加入另一種對抗原一的一次抗ti，與待測抗原進行鍵結

d. 洗去多余未鍵結一次抗ti，加入帶有酶的二次抗ti，與一次抗ti鍵結

e. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結果

原理：針對抗原分子上2個不同抗原決定簇的單克隆抗ti分別作為固相抗ti和酶標抗ti，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物。

2. 間接法

間接法常用于檢測抗ti，一般的操作步驟為：

a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余的抗原。

b. 加入待測檢體，檢體中若含有待測的一次抗ti，則其會與塑膠孔盤上的抗原進行一性鍵結。

c. 洗去多余待測檢體，加入帶有酶的二次抗ti，與待測的一次抗ti鍵結。

d. 洗去多余未鍵結二次抗ti，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測定塑膠盤中的吸光值（OD值），以評估有色終產物的含量即可測量待測抗ti的含量。

原理：利用酶標記的抗抗ti以檢測已與固相結合的受檢抗ti。

3. 競爭法

競爭法是一種較少用到的ELISA檢測機制，一般用于檢測小分子抗原，其操作步驟為：

a. 將具有一性的抗ti固著于塑膠孔盤上，完成后洗去多余抗ti

b. 加入待測檢體，使檢體中的待測抗原與塑膠孔盤上的抗ti進行一性鍵結

c. 加入帶有酶的抗原，此抗原也可與塑膠孔盤上的抗ti進行一性鍵結，由于塑膠孔盤上固著的抗ti數(shù)量有限，因此當檢體中抗原的量越多，則帶有酶的抗原可鍵結的固著抗ti就越少，亦即，兩種抗原皆競相與塑膠孔盤上抗ti鍵結，即所謂競爭法之由來。

d. 洗去檢體與帶有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，當檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤內留下之帶有酶的抗原越少，顯色也就越淺。

e. 當需要偵測無法獲得兩種以上單一性抗ti的抗原，或是不易得到足夠的純化抗ti以固著于孔盤上時，一般會考慮使用競爭法ELISA。

免責聲明：

1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗，否則所產生的一切后果，由實驗者承擔，本公司概不負責。

2. 嚴格按照說明書操作，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔。

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