細(xì)胞培養(yǎng)步驟

1) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1. 準(zhǔn)備 McCOY＇s 5A 培養(yǎng)基(McCOY＇s 5A，SIGMA,貨號 M4892，添加 NaHC03 2.2g/L)，90%;you質(zhì)胎牛血清，10%。

2. 培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%;碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3. 凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2) 細(xì)胞處理：

復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 lmL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37°C 水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 l-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 l〇cm皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。隔天換液并檢查細(xì)胞密度。

細(xì)胞凍存：

待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法步驟進(jìn)行， 重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加 DMSO 至終濃度為10%。加入 DMSO 后迅速混勻，按每 lml 的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于 1X106個(gè)細(xì)胞凍存。

細(xì)胞接受后的處理：

1. 收到細(xì)胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。

2. 請先在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將 T25瓶置于 37°C 培養(yǎng)約 2-3h〇

3. 棄去 T25瓶中的培養(yǎng)基，添加 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。

4. 如果細(xì)胞長滿（90%以上）請及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳代培養(yǎng)用 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。

5. 接到細(xì)胞次日，請檢查細(xì)胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時(shí)與我們?nèi)〉寐?lián)系。

培養(yǎng)方法：

收到細(xì)胞后，在倒置顯微鏡下觀察整個(gè)細(xì)胞生長情況：

如果細(xì)胞未長滿，用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒后放到超菌臺內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶，留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

如果細(xì)胞已長滿（達(dá)80-90%）。即可進(jìn)行傳代，具體步驟如下：

a，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶內(nèi)加入1.0-2.0ml酶液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞。

c，加入等量的的培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻后吸出一半，分到新的培養(yǎng)

d，傳代比例：1:2-1:3

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心 5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 l-2mL 培養(yǎng)液后吹句，將細(xì)胞懸液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 養(yǎng)基的 新皿中或者瓶中。 

 方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì) 胞懸 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

操作要點(diǎn)：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動(dòng)凍存管，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細(xì)胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細(xì)胞懸液。

5）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶內(nèi)，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

6）隔天觀察細(xì)胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過2~3次傳代，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

友情提示注意以下幾點(diǎn)：

1、收到細(xì)胞后請盡快更換為含15%血清的新鮮培養(yǎng)基，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶，請?jiān)谠�瓶培養(yǎng)基中額外添加10%的血清

2、貼壁細(xì)胞收到當(dāng)天切忌立刻消化，請將細(xì)胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到隔天再做消化傳代，請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進(jìn)行傳代培養(yǎng)

3、如簽收時(shí)出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂，漏液等情況請及時(shí)做好照片記錄并聯(lián)系實(shí)驗(yàn)室

細(xì)胞用途：僅供科研使用。