細胞培養(yǎng)步驟

1) 培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1. 準備 McCOY＇s 5A 培養(yǎng)基(McCOY＇s 5A，SIGMA,貨號 M4892，添加 NaHC03 2.2g/L)，90%;you質胎牛血清，10%。

2. 培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%;碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3. 凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2) 細胞處理：

復蘇細胞：將含有 lmL 細胞懸液的凍存管在 37°C 水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 1000RPM 條件下離心 4分鐘，棄去上清液，補 加 l-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 l〇cm皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。隔天換液并檢查細胞密度。

細胞凍存：

待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法步驟進行， 重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加 DMSO 至終濃度為10%。加入 DMSO 后迅速混勻，按每 lml 的數(shù)量分配到凍存管中。本公司按每個凍存管細胞數(shù)目大于 1X106個細胞凍存。

細胞接受后的處理：

1. 收到細胞后，請檢查是否漏液，如果漏液，請拍照片發(fā)給我們。

2. 請先在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)，去掉封口膜并將 T25瓶置于 37°C 培養(yǎng)約 2-3h〇

3. 棄去 T25瓶中的培養(yǎng)基，添加 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。

4. 如果細胞長滿（90%以上）請及時進行細胞傳代，傳代培養(yǎng)用 6ml 本公司附帶的完全培養(yǎng)基。

5. 接到細胞次日，請檢查細胞是否污染，若發(fā)現(xiàn)污染或疑似污染，請及時與我們取得聯(lián)系。

培養(yǎng)方法：

收到細胞后，在倒置顯微鏡下觀察整個細胞生長情況：

如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶，留10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

如果細胞已長滿（達80-90%）。即可進行傳代，具體步驟如下：

a，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗1-2次。

b，向瓶內加入1.0-2.0ml酶液，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，吸取酶，加含有6ml 含10%血清的培養(yǎng)液，輕輕吹打細胞。

c，加入等量的的培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻后吸出一半，分到新的培養(yǎng)

d，傳代比例：1:2-1:3

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心 5分鐘，棄去上清液，補加 l-2mL 培養(yǎng)液后吹句，將細胞懸液按 1: 2到 1: 5的比例分到新的含 8ml 培 養(yǎng)基的 新皿中或者瓶中。 

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細胞懸起，將細 胞懸 液按 1: 2到 1: 3的比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

操作要點：

1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。

2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內，再逐步轉移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內完全解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。

3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內，將管內細胞轉移至準備好的離心管內，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉移至離心管內。

4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。

5）將細胞懸液轉移至T25細胞瓶內，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內培養(yǎng)。

6）隔天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。

友情提示注意以下幾點：

1、收到細胞后請盡快更換為含15%血清的新鮮培養(yǎng)基，如因特殊情況需要繼續(xù)使用原瓶，請在原瓶培養(yǎng)基中額外添加10%的血清

2、貼壁細胞收到當天切忌立刻消化，請將細胞換液后放置培養(yǎng)箱孵育到隔天再做消化傳代，請優(yōu)先選擇直徑6cm的培養(yǎng)皿進行傳代培養(yǎng)

3、如簽收時出現(xiàn)培養(yǎng)瓶壁破裂，漏液等情況請及時做好照片記錄并聯(lián)系實驗室

細胞用途：僅供科研使用。