學習目的與要求：
1、了解色譜分離技術的概念、分離工作原理
2、掌握各種色譜分離技術的主要操作步驟
重點與難點：
掌握幾種色譜分離技術的主要操作步驟
教學方法：多媒體
一、色譜技術的概念
概念：色譜技術是一組相關分離方法的總稱，色譜柱的一般結(jié)構(gòu)含有固定相（多孔介質(zhì)）和流動相，根據(jù)物質(zhì)在兩相間的分配行為不同（由于親和力差異），經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），達到分離的目的。
簡單的說，色譜技術是在特定的色譜柱當中，利用不同物質(zhì)與固定相的親和力差異而實現(xiàn)分離的一組技術。其優(yōu)點是分辨率高，是生化產(chǎn)品純化、分析的重要手段，這一切均源于其特殊的分離模式，即塔板理論
二、色譜分離方法的分類
色譜分離方法很多，種類有四、五十種。但常用于生物大分子分離的色譜方法，按機理分，有以下幾種：
1、吸附色譜
2、分配色譜
3、離子交換色譜
4、凝膠色譜
三、吸附色譜
1、原理：利用溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力（范德華力，包括色散力、誘導力、定向力以及氫鍵）的差異而實現(xiàn)分離
2、關鍵要素：吸附劑（固定相）和展開劑（流動相）的選擇
3、吸附劑：氧化鋁、硅膠、聚酰胺等，均含有不飽和的氧原子或氮原子以及能夠形成氫鍵的基團，如-OH和-NH2
4、常用的吸附劑：
氧化鋁、硅膠、活性炭、纖維素、聚酰胺、硅藻土
5、展開劑的選擇
展開劑極性越大，對同一化合物的洗脫能力越大
因此，可以根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整展開劑的極性以獲得*佳的分離的效果
展開劑選擇的原則：
（1）對被分離組分應具有一定的解吸附能力，極性應比被分離物質(zhì)的極性略小
（2）展開劑應對被分離物質(zhì)具有一定的溶解能力
6、吸附色譜的操作程序
（1）根據(jù)要分離組分的性質(zhì)（包括極性、分子量、分子結(jié)構(gòu)）選擇合適的固定相和流動相
（2）吸附操作：選擇合適的操作條件（溫度、pH值、流速），進行裝柱、平衡、上樣，測定穿透樣品含量以調(diào)整操作參數(shù)
（3）洗脫：采用有機溶劑洗滌、調(diào)節(jié)pH值以及體系離子強度，限度地回收目標產(chǎn)物
四、分配色譜
1、原理：利用溶質(zhì)在固定相和流動相之間的分配系數(shù)不同而分離的方法
2、構(gòu)成要素：固定相、載體、流動相
載體：通常為惰性材料，能吸附固定相液體
載體種類：
硅膠、硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠
固定相：通常選取各組分溶解度大的溶劑作為固定相
流動相可以是極性的（反相色譜法），也可以是非極性的（正相色譜）
*反相色譜 固定相是非極性的流動相是極性的
3、高效液相（HPLC）
是一種典型的分配色譜，它是基于化合物在固定相和流動相之間分配系數(shù)的差異而實現(xiàn)分離的，由于經(jīng)過了多次的吸附－解析－吸附的過程，其理論塔板數(shù)可高達數(shù)萬（分析性HPLC）

4、反相液相色譜
反相液相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)使基于蛋白質(zhì)的疏水性，因此通常采用非極性的烷基固定相作為填料，其表面化學性質(zhì)和流動相的選擇應限度地滿足疏水的要求
載體：微粒多孔硅膠（粒徑5μm~20μm ）
Hypersil?? Spherosil XOB075
固定相：C18、C8烷基鏈，C8適于分離蛋白質(zhì)
C18適于分離核酸
苯基
流動相的選擇
通常采用有機溶劑，乙腈、異丙醇、正丙醇和四氫呋喃

五、離子交換色譜
1、概念：以離子交換樹脂作為固定相，選擇合適的溶劑作為流動相，使溶質(zhì)按照其離子交換親合力的不同而得到分離的方法
2、常用的離子交換樹脂
（1）葡聚糖凝膠型?
DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25
（2）纖維素系列離子交換劑
DEAE-Sephacel? Cellex系列?
（3）瓊脂糖系列離子交換劑
Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow
Bio-Gel A 系列交聯(lián)瓊脂糖離子交換劑
（4）Source 系列離子交換劑
特點：介質(zhì)均勻、分辨率高、流速快、反壓低
陽離子交換樹脂? S系列
陰離子交換樹脂? Q系列
（5）MonoBeads 系列離子交換劑
特點：介質(zhì)為親水性聚醚，具有和Source系列相同的優(yōu)點，但動態(tài)載量更大，壽命更長。
同樣分為Q系列和P系列
六、凝膠色譜（, GPC）
1、概念：在樣品通過一定孔徑的凝膠固定相時，由于流經(jīng)體積的不同，使不同相對分子量的組分得以分離
2、特點：
操作簡便
分離效果好，重復性高，回收率高
分離條件溫和
應用廣泛 適用于生物大分子的初級分離，脫鹽
分辨率低

3、分子篩凝膠色譜原理
不同的化合物由于其大小差異，在流經(jīng)GPC柱時，不同分子量的化合物流經(jīng)體積不同（大分子不能或難以進入凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，直接從凝膠顆粒之間穿過，保留時間短；而小分子恰恰相反，保留時間較長）而得以分離（如上圖所示）
七、疏水作用層析

由于不同蛋白質(zhì)分子氨基酸組成差異，其疏水性也不盡相同，HIC技術是基于生物大分子的疏水性差異而實現(xiàn)分離的，該方法彌補了HPLC難以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離的不足。具體方法是：
在高鹽環(huán)境下，蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域暴露，固定相表面修飾了一些疏水的基團，這樣蛋白質(zhì)的疏水部分即可與固定相發(fā)生較強的疏水相互作用，從而被結(jié)合在固定相表面，而一旦降低流動相的鹽濃度即可實現(xiàn)蛋白質(zhì)的洗脫（見下圖），方便易行，是蛋白質(zhì)分離的常用手段。
八、親和色譜
所謂親和色譜就是將親和技術和色譜技術集成得到的一種高效分離手段，其原理與親和吸附基本類似，所不同的是經(jīng)過修飾的載體顆粒是填充在色譜柱中，以實現(xiàn)連續(xù)的色譜分離
載體活化、配基連接、吸附、洗脫

九、蛋白質(zhì)分離常用的色譜方法
1、免疫親和層析
屬于吸附色譜中的一種，利用抗原-抗體作用的高度專一性以及較強的吸附力，實現(xiàn)特殊蛋白質(zhì)的分離
免疫親和層析介質(zhì)的獲得：
（1）獲得抗體
（2）抗體連接到載體上
2、疏水層析
在載體表面連接上疏水的直鏈碳鏈或其他疏水基團，如苯基，可以與蛋白質(zhì)的某些疏水基團相互作用，從而實現(xiàn)多組分的分離。
3、離子交換色譜是*常用的蛋白質(zhì)分離手段
操作要點：
由于蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在不同的pH值下，其解離程度是不同的，因此既可以采用陽離子交換，也可以用陰離子交換，可視具體情況而定
由于蛋白質(zhì)的極性基團很多，為了避免洗脫困難，通常采用弱陽或弱陰離子交換劑
適當調(diào)節(jié)緩沖溶液的pH值，使蛋白質(zhì)適當解離，通常采用的pH值靠近其等電點（不是等電點）
緩沖溶液的離子強度不能過高，通常在10~20m mol
層析方案的確定，需要視試驗情況作適當調(diào)整
洗脫方式：pH梯度
離子強度梯度
思考題：
1、色譜方法共分幾類？常用的蛋白質(zhì)分離方法有哪些？并簡述其原理

• 何為理論塔板高度和理論塔板數(shù)？如何計算？
• 簡述高效反相液相色譜的工作原理？
• 試分析HPLC和HIC技術的異同

原創(chuàng)作者：杭州瑞析科技有限公司