β-欖香烯和 NDV 共修飾對(duì)脂質(zhì)體瘤苗的免疫增強(qiáng)作用
高天慧 段芳齡 劉明月 李曉燕 戚麟

【摘要】 目的  通過(guò)脂溶性的抗腫瘤藥物 β-欖香烯和新城疫病毒( Newcastle  Disease  Virus，NDV) 對(duì) H22 肝癌細(xì)胞可溶性抗原( NDV- H22 抗原) 脂質(zhì)體瘤苗的共同修飾，來(lái)增強(qiáng)瘤苗的抗肝癌效應(yīng)，為臨床抗肝癌的免疫治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 用 NDV 的弱毒株 losota 株感染 H22 肝癌細(xì)胞。用 KCl 法提取可溶性抗原。用改進(jìn)的機(jī)械分散法制備多復(fù)層脂質(zhì)體( MLV) 。將 60 只 BalB / c 鼠腹腔接種 H22 肝癌細(xì)胞后隨機(jī)數(shù)字法分為 3 組，每組再分為兩部分，24 小時(shí)后，分別腹腔接種: 脂質(zhì)體包裹 NDV 修飾的 H22 抗原( LVAg 組) 、脂質(zhì)體共包裹 β-欖香烯與 H22 抗原的制劑( LEAg  組) 、脂質(zhì)體共包裹 NDV-H22 抗原與 β-欖香烯的制劑( LEVAg) 。1 周后進(jìn)行第二次免疫接種。記錄小鼠的生存期，MTT 法測(cè)定淋巴細(xì)胞毒活性。結(jié)果  LEVAg 組的抗腫瘤效應(yīng)*強(qiáng)，其生存期為( 45. 8 ± 3. 8) d，脾淋巴細(xì)胞毒活性為( 46. 4 ± 1. 9) ，
均高于 LVAg 分別為［( 35. 2 ± 5. 5) d 和( 30 ± 2. 8) ］和 LEAg 組分別為［( 37. 8 ± 3. 7) d 和( 29. 0 ± 1. 5) ］ ( P ＜ 0. 001) ; LVAg 和 LEAg 組小鼠的生存期及脾淋巴細(xì)胞毒活性無(wú)顯著性( P ＞ 0. 05) 。結(jié)論 將 NDV-
H22 抗原和 β-欖香烯共包入脂質(zhì)體中，其抗肝癌免疫效應(yīng)明顯增強(qiáng)，二者有協(xié)同增效作用。
【關(guān)鍵詞】 β-欖香烯; 新城疫病毒; 脂質(zhì)體瘤苗
腫瘤疫苗作為手術(shù)及放療、化療的輔助治療常用來(lái)改善宿主的免疫狀態(tài)，調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，殺滅殘留在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。但是由于放療、化療的毒副作用及癌癥本身，患者的免疫系統(tǒng)往往處于抑制狀態(tài)，同時(shí)腫瘤抗原性弱，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 MHC-I 類分子減少或缺如，不能有效地將腫瘤抗原提呈給 CD + T 細(xì)胞，因此，單純用腫瘤抗原進(jìn)行免疫治療，往往不能誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究采用新城疫病毒( Newcastle Disease Virus，NDV) losota 株來(lái)修飾 H22 肝癌細(xì)胞， 并將 NDV 修飾的 H22 肝癌細(xì)胞可溶性抗原( NDV-H22 抗原) 與免疫增強(qiáng)劑 β-欖香烯共包于脂質(zhì)體中，以期得到更進(jìn)一步的抗瘤效應(yīng)，為臨床抗肝癌治療提供依據(jù)。
1 資料與方法
1.1 一般資料 BalB / c 純系小鼠，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為 SYXK( 豫) 2005-0012，4-6 周齡，體重 16 ～ 18  g，健康，清潔級(jí)飼養(yǎng)，60 只，雌雄各半; 小鼠 H22 肝癌細(xì)胞由 BalB / c 小鼠腹腔傳代，引自河南省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所; 新城疫病毒losota 株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)學(xué)院微生物教研室盧中華教授惠贈(zèng)。大豆卵磷脂( PC) ，上海油脂一廠; 膽固醇( CH) ，日本株式會(huì)社; 十八烷氨( SA) ，sigma; 牛血清白蛋白，B1B 公司; 新生小牛血清，天津正江技術(shù)開發(fā)公司;
淋巴細(xì)胞分離液，上海勁馬生物科技有限公司;   β-欖香烯，大連金港制藥有限公司。Beckman 高速低溫離心機(jī)，Beck-
man 公司; Eppendorf 高速低溫離心機(jī) C5417R，Eppendorf 公司; CO2 培養(yǎng)箱，美國(guó) A1SCO; 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海玻璃儀器二廠; 倒置顯微鏡，日本 OLYMPUS; 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，第四軍醫(yī)大學(xué)。
1.2 方 法
1． 2． 1    新城疫病毒修飾肝癌細(xì)胞及可溶性抗原的制備參照文獻(xiàn)［1］進(jìn)行。
1． 2． 2    脂質(zhì)體的制備及包封率測(cè)定 參照我所建立的方法［1-3］略加改進(jìn)。
1． 2． 3    瘤苗的治療實(shí)驗(yàn)
1． 2． 3． 1    分組  將 60 只 BalB / c 小鼠隨機(jī)分為為 3 組，每組再分為兩部分，一部分用于觀察生存期，另一部分用來(lái)檢測(cè) 淋巴細(xì)胞對(duì) H22 肝癌細(xì)胞的體外殺傷效應(yīng)。第 1 組為脂質(zhì)體包裹 NDV 修飾的 H22 抗原組( LVAg 組) ，第 2 組為脂質(zhì)體共包裹 β-欖香烯和 H22 抗原組( LEAg 組) ，第 3 組為脂質(zhì)體共包裹 β-欖香烯和 NDV-H22 抗原組( LEVAg 組) 。
1． 2． 3. 2    免疫治療程序 第 1 天各小鼠腹腔接種 H22 肝癌細(xì)胞 1. 1 × 106   個(gè)/0. 1  ml，24  h 后腹腔接種各種疫苗 0. 1  ml，每毫升疫苗含 3 × 107 個(gè) H 肝癌細(xì)胞所含的抗原，次免疫后一周強(qiáng)化免疫一次。
1. 3 淋巴細(xì)胞對(duì) H22 肝癌細(xì)胞的體外殺傷試驗(yàn)
1. 3. 1    脾淋巴細(xì)胞懸液的制備  第二次免疫后 4  d，將用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞毒作用的小鼠取出，常規(guī)腹部消毒，無(wú)菌取脾，D-
Hanks 沖洗，玻璃勻漿器勻漿后過(guò) 200 目金屬網(wǎng)，淋巴細(xì)胞分離液分離、制備淋巴細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)至 5 × 105  個(gè)/100 μ1。
1. 3. 2    脾淋巴細(xì)胞對(duì) H22 肝癌細(xì)胞的體外殺傷試驗(yàn) 參照黃永年［4］等的方法進(jìn)行。
1. 4    小鼠生存期的觀察 每天記錄各組小鼠存活數(shù)量，從接種之日起，連續(xù)觀察 50  d，存活 ＞ 50  d 者，認(rèn)為長(zhǎng)期存活。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS 11. 5 軟件，應(yīng)用方差分析 ONE- WAY-ANOVA 對(duì)生存期和淋巴細(xì)胞毒活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P ＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1 KCl 法提取的可溶性抗原的蛋白含量 每 106 個(gè) H 肝癌細(xì)胞所抽提的蛋白為 107μg，每 106   個(gè) NDV 修飾后 H肝癌細(xì)胞所抽提的蛋白為 119 μg。
2. 2 脂質(zhì)體的包封率 脂質(zhì)體對(duì) LVAg、LEAg、LEVAg 的包封率分別 39. 45% ，44. 38% 和 39. 45% ，對(duì) β-欖香烯的包封率為 81. 36% 。
2. 3 不同免疫治療的效應(yīng)觀察
2. 3. 1 不同的免疫治療對(duì) BalB / c 小鼠生存期的影響  對(duì)荷瘤小鼠分別用不同的疫苗制劑間隔 1 周進(jìn)行連續(xù)兩次的免疫后，LVAg 組、LEAg 組和 LEVAg 組的平均生存期分別為 ( 35. 2 ± 5. 5) d、( 37. 8 ± 3. 7) d 和( 45. 8 ± 3. 8) d，3 組間差異有顯著性( F = 15. 823，P ＜ 0. 001) ，其中，LEVAg 組的平均生存期長(zhǎng)于 LVAg 組( P ＜ 0. 001) 和 LEAg 組( P ＜ 0. 001) ，而后二者之間差異無(wú)顯著性( P = 0. 197) 。
2. 3. 2 不同免疫治療組小鼠脾淋巴細(xì)胞體外殺傷 H22 肝癌細(xì)胞活性觀察 在效靶比為 50: 1  時(shí)，LVAg 組、LEAg 組和
LEVAg 組的脾淋巴細(xì)胞毒活性分別為: ( 30. 0 ± 2. 8) 、( 29. 0
± 1. 5) 和( 46. 4 ± 1. 9) ，3 組間差異有顯著性( F = 210. 105，P
＜ 0. 001) ，其中，LEVAg 組的脾淋巴細(xì)胞毒活性強(qiáng)于 LVAg
組( P ＜ 0. 001) 和 LEAg 組( P ＜ 0. 001) ，而后二者之間差異無(wú)顯著性( P = 0. 322) 。
3討論
脂質(zhì)體包裹可增加抗原的顆粒性，較可溶性抗原更易被 抗原提呈細(xì)胞吞噬和提呈［5］。巨噬細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體具有優(yōu)先 攝取，脂質(zhì)體包裹的抗原可經(jīng)巨噬細(xì)胞的 MHC-Ⅰ途徑激活CD + T 細(xì)胞，發(fā)揮主要的抗瘤作用，同時(shí)又可經(jīng) MHC-Ⅱ途徑激活 CD +  T 細(xì)胞，CD +  T 細(xì)胞( 包括 Th 細(xì)胞)  被激活后釋放細(xì)胞因子，一方面促進(jìn)激活的 CD + T 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，另一方面促進(jìn) B 細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫，促進(jìn)機(jī)體的抗瘤免疫作用。
病毒用于抗腫瘤免疫治療*初源于“病毒異種化作用” 的概念，即通過(guò)使腫瘤細(xì)胞表面帶有外來(lái)病毒相關(guān)抗原，增強(qiáng)其免疫原性，易于為宿主的免疫系統(tǒng)識(shí)別。NDV 是禽類的一種副粘液病毒，對(duì)癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的親和力，可在癌細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，而對(duì)正常細(xì)胞影響不大［6］。體外實(shí)驗(yàn)中，NDV致敏可顯著增加DC-CIK 對(duì)于胃癌細(xì)胞株的殺傷力［7］。在臨床研究中，NDV 修飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗能改善晚期結(jié)腸癌患者的生存［8］。
欖香烯為脂溶性的非細(xì)胞毒性的廣譜抗腫瘤藥物，同時(shí)又具有免疫增強(qiáng)作用。欖香烯能改變或增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，誘發(fā)或促進(jìn)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫排斥作用［9］。此外， 欖香烯能顯著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，增強(qiáng) CONA 誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞的增殖，增加 NK 細(xì)胞的活性［10］。
本研究用 NDV 修飾脂質(zhì)體瘤苗，以增強(qiáng)腫瘤抗原的免疫原性，更易為宿主識(shí)別，同時(shí)用免疫增強(qiáng)劑欖香烯來(lái)刺激 機(jī)體免疫反應(yīng)，獲得了*強(qiáng)的抗瘤免疫效應(yīng)，顯著高于單用
NDV  修飾脂質(zhì)體瘤苗和單用欖香烯修飾脂質(zhì)體瘤苗，提示二者的協(xié)同增效作用。免疫效應(yīng)的增強(qiáng)可能源于欖香烯的免疫增強(qiáng)作用，NDV 的抗原異源化作用，以及脂質(zhì)體包裹后的抗原提呈的作用的加強(qiáng)。共包裹欖香烯和 NDV 修飾的脂質(zhì)體肝癌瘤苗有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，為抗肝癌治療提供有效 的補(bǔ)充手段，值得臨床進(jìn)一步研究。
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