雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）目前由兩個主要的應(yīng)用向，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價結(jié)合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，
第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控，通過生物信息學(xué)法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計合適的microRNA質(zhì)粒或干預(yù)片段，同時構(gòu)建靶基因的報告基因質(zhì)粒，二者同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響（上調(diào)或下調(diào)）靶基因的研究法。
實(shí)驗(yàn)原理：
1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）
2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
  實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 用生物信息學(xué)法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2） 設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中。
（3） 篩選陽性克隆，測序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。
（5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
（7） 用適當(dāng)?shù)姆ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測。
（8） 加入酶作用底物，于熒光計數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。
（9） 計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。
雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）目前由兩個主要的應(yīng)用向，是檢測轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動子區(qū)DNA相互作用，轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動子中的特異順序結(jié)合，淳風(fēng)生物科技,.淳風(fēng)生物科技|||哈爾濱雙熒光素酶報告基因技術(shù)服務(wù)
,西安淳風(fēng)生物科技有限公司，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域和順式因子實(shí)現(xiàn)共價結(jié)冂合，從而對基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)（luciferase Assay）是檢測這類轉(zhuǎn)錄因子和其靶啟動子中的特異順序結(jié)合的重要手段，
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實(shí)驗(yàn)原理：
1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前的報告基因疋質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）
2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
  實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 用生物信息學(xué)法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2） 設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中。
（3） 篩選陽性克隆，測序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。
（5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
（7） 用適當(dāng)?shù)姆ㄌ崛〉鞍撞⒂糜跓晒馑孛笝z測。
（8） 加入酶作用底物，于熒光計數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。
（9） 計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。
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第二是研究微小RNA(microRNA)對于靶基因的調(diào)控，通過生物信息學(xué)法預(yù)測microRNA潛在的靶基因以及干預(yù)位點(diǎn)序列，并設(shè)計合適的microRNA質(zhì)粒或干預(yù)片段，同時構(gòu)建靶基因的報告基因質(zhì)粒，二者同時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是確定microRNA是否能影響（上調(diào)或下調(diào)）靶基因的研究法。
實(shí)驗(yàn)原理：
1）構(gòu)建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達(dá)序列前的報告基因質(zhì)粒，如pGL3-basic（轉(zhuǎn)錄因子與靶基因）或pMIR-REPORT Luciferase質(zhì)粒（微小RNA與靶基因）
2） 將要檢測的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒）與報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞或目的細(xì)胞。如果此轉(zhuǎn)錄因子（或microRNA）能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達(dá)，熒光素酶的表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄因子的作用強(qiáng)度成正比。
3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生熒光素，通過檢測熒光的強(qiáng)度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉(zhuǎn)錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。
  實(shí)驗(yàn)步驟：
（1） 用生物信息學(xué)法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
（2） 設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中。
（3） 篩選陽性克隆，測序，擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。
（4） 擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒（或microRNA質(zhì)粒），提純備用，同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照。
（5） 培養(yǎng)293細(xì)胞（或其它目的細(xì)胞），并接種于6孔板中，生長24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
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（8） 加入酶作用底物，于熒光計數(shù)儀上測定熒光素酶的活性。
（9） 計算相對熒光強(qiáng)度，并與空載對照比較，判斷影響因子是否有效的作用于靶基因。

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