免疫組化：

        融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來對組織（細胞）內抗原(多肽和蛋白質)進行定位、定性及相對定量的研究(主要是定位)。樣本是細胞或組織，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。要在顯微鏡下觀察結果，可能出現(xiàn)膜陽性、質陽性和核陽性。

免疫印跡（immunoblotting）又稱蛋白質印跡（Western blotting），

       是根據(jù)抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。先要進行SDS-PAGE，然后將分離開的蛋白質樣品用電轉儀轉移到固相載體上，而后利用抗原-抗體-標記物顯色來檢測樣品，可以用于定性和半定量。結合化學發(fā)光檢測，可以同時比較多個樣品同種蛋白的表達量差異。

實驗目的

免疫組化 IHC / IF / ICC ——蛋白定位檢測分析

定位較直接準確

定性靈敏度高

半定量（高質量染色，背景淺，特異性強的切片；表達量較多的蛋白）

免疫印跡試驗 Western blot

測樣品內蛋白含量，定量較IHC更準確

定性和間接定位，敏感性遠遠低于免疫組化技術

二：免疫組化、免疫印跡對比——實驗（抗體）準備

實驗準備-抗體

品牌選擇：文獻出處(biorbyt目前有1000個一抗在外文文獻中引用)，試用裝預實驗

        biorbyt可以提供各種研究領域159052種不同貨號的一抗，包括單抗/多抗，直標抗體，磷酸化抗體，病毒抗體；各種標記的二抗

biorbyt目前有1000多個抗體產品已在外文文獻中引用

 以CD133 antibody orb99113為例

一抗:    

－－-抗體名稱（蛋白全名，uniprot ID）

－－-實驗類型（IHC, WB, FACS,ELISA）

－－-來源/種屬（rabbit，mouse，rat, human, goat等）

－－-react with （human, mouse, rat, chicken,sheep, cow, pig,  guinea pig等）

－－-單抗（特異性高，親和力弱，靈敏度低），多抗（特異性低，親和力強，靈敏度高）

－－-分析樣本中目的蛋白的結構性質（待測樣本蛋白結構域，樣品處理過程影響）

二抗               

－－-根據(jù)一抗種屬來源而決定二抗來源

－－-標記物的選擇。有HRP, Biotin, FITC,CY3, CY5, PE

直標一抗      

－－-適用于直接免疫實驗（組化，熒光，流式，WB）特異性高，避免非特異染色，快速方便，敏感度低

－－-親和性好的抗體才能進行抗體標記

抗體穩(wěn)定性

－－純度，高純度，保障其的穩(wěn)定性

－－濃度，高濃度減少容器表面吸附造成的物質損失，穩(wěn)定性更好

抗體保存

－－避免反復凍融，分裝保存在-20℃

－－復融抗體：如果一次用不完，將剩余母液保存在4℃，避免再凍起來

－－抗體工作液：應該當天配制當天用完，4℃保存盡量不要超過1天

－－大部分抗體收到后4℃短暫保存1~2周對抗體活性沒有影響

－－運輸條件：一般的運輸過程需要1~2周的時間，在低溫4℃的條件下來完成的
  三：免疫組化、免疫印跡對比——實驗（樣本）準備

實驗準備-免疫組化實驗樣本

 （新鮮，固定方式，充分脫水，防脫處理）

1.取材新鮮，及時固定：防止離體太久而發(fā)生組織自溶長菌，抗原擴散或丟失，易保存

2.固定液： 

（1）醛類：形態(tài)結構保存好，穿透性強，組織收縮少；醛基與蛋白氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇不能充分暴露，需要抗原修復

- 4%多聚甲醛（常用，適用大多數(shù)組織，細胞）

- 10%福爾馬林/甲醛（常用，脂肪類，脊髓類）

-戊二醛（微細結構保存好，用于電鏡）

（2）醇類：穿透性強，脫水性強，易引起組織收縮，使蛋白變性作用輕，抗原可流失。

-乙醇，甲醇

（3）其他固定劑

-丙酮，抗原保存性好，脫色性更強，常用于部分細胞爬片

-混合固定劑，Bouni 液，Zamboni液，AAF液等

固定時間：醛類建議24小時以內，醇類，丙酮2小時以內，組織大小厚度略有差異

3. 充分脫水：保存時間長，防止裂片，保持組織結構，防止冰切形成冰晶

4. 防脫處理：防止掉片，多聚賴氨酸防脫切片，明膠和硫酸鉻鉀處理等

免疫組化切片類型

1.石蠟切片

易保存（干燥低溫4~8℃保存），厚度3~6um，結構形態(tài)好，需要抗原修復，抗原活性偏低（烤片，固定等）

2.冰凍切片

不易保存（-80℃保存半年），厚度10~20um，形態(tài)結構較差，抗原活性高，不一定抗原修復，胞內核內抗原需打孔

冰凍切片是否需要抗原修復？如何固定？

（1）不能及時切片染色觀察：可選擇固定（24小時內）后切片，需要修復；或馬上包埋切片后固定（10 min以內），可修復可不修復

（2）馬上切片染色觀察的，可不固定，可不修復

3.細胞爬片（貼壁，半貼壁，懸�。�

單層細胞，均勻爬片，選擇合適的固定方式保證細胞形態(tài)，細胞周期同一化，不需要修復

－－-培養(yǎng)皿/平板                               －－-蓋玻片爬片

實驗準備-WB實驗樣本

新鮮制備，低溫 裂解 （全蛋白，不包括核抽提、亞細胞器分離等）

裂解液，蛋白酶抑制劑，磷酸酶抑制劑

研磨（組織），液氮（小體積組織），超聲波（細菌/細胞）

跑膠，蛋白定量

Notice：

防止蛋白降解，磷酸化蛋白防止去磷酸化

濃度低蛋白量少不易檢測，濃度高裂解液粘稠不易吸取

分泌型蛋白，無血清細胞培養(yǎng)收集上清，TCA沉淀富集

四：免疫組化、免疫印跡對比——實驗方案

實驗方案-免疫組化 IHC-P

脫蠟和水化，時間由二甲苯新鮮程度和室溫等綜合決定

抗原修復，修復強度：高壓修復>微波修復>胰酶修復；修復液多種，EDTA>檸檬酸；85~95℃處理約15min，自然冷卻至室溫

細胞通透，TritonX-100, >10 um厚切片

滅活內源性過氧化物酶和生物素，3% H2O2 10~12min

血清封閉，小牛血清、BSA、羊血清, 不能與一抗來源一致

抗體孵育，濃度*重要，溫度決定反應速度，時間決定反應量

－－- 4℃過夜（16~24h），次日37 ℃復溫 30 min，反應溫和，背景淺

－－- 37 ℃ （1-2 h），反應速度快，時間短

－－- 室溫，無法保證每次環(huán)境溫度控制在一定范圍，不建議

抗體稀釋液（PBS, 專用的, PH7.4）

切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗，普通5 min*3 ，抗體10min*4）

DAB顯色，由顯微鏡下控制顯色時間，決定背景的深淺和特異性染色的深淺

復染，目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位，胞漿蛋白適當時間長一點，核蛋白則要短。

長期保存，高倍鏡觀察，需脫水透化

封片，中性樹膠等封片，避免產生氣泡

免疫熒光注意避光，防止熒光衰減淬滅，防止自發(fā)熒光現(xiàn)象

雙標免疫熒光實驗設計

2個間標抗體，需要不同host，不同的熒光標記物

2個直標抗體，可以同host，不同的熒光標記物

1個間標抗體+1個直標抗體，不同host，不同熒光標記物，兩抗體可共同孵育

1個間標抗體+1個直標抗體，同host，不同熒光標記物，需先孵育間標+二抗，后再孵育直標

實驗方案-Western blot

  跑膠，分離膠濃度，轉膜條件

  膜的選擇  0.45/0.22

  －－- NC，操作簡單，強結合力，背景低，信噪比高，脆易卷，經(jīng)不起多度洗滌，適用多種顯色

 －－-PVDF，蛋白截留力（強6倍）、機械強度、化學耐受性更強，不適用熒光，預處理

  監(jiān)測轉膜

  封閉，5%脫脂奶粉/血清封閉（4℃過夜，或37℃ 搖床1~2 hour）

  抗體孵育（4℃過夜，或37℃ 搖床 1~2 hour）

  抗體稀釋液

  洗膜 （3~4次，7~10min/次）

  曝光

免疫組化結果常見問題分析

結果陰性的原因

1. 抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤； 

2. 抗原修復不全，換修復液或加強修復；

3. 組織切片本身這種抗原含量低，設陽性對照片；

4. 血清封閉時間過長；DAB 孵育時間過短；

6. 細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。

非特異性染色的原因（著色一片黃/背景深）

1. 抗體孵育時間過長，抗體濃度；

2. 多抗易出現(xiàn)非特異性，可選擇單抗；

3. 內源性過氧化物酶和生物素滅活不夠；

4. 非特異性組分與抗體結合，延長血清封閉時間；

5. DAB 孵育時間過長或濃度過高；

6. PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色；

7. 標本染色過程中經(jīng)常出現(xiàn)干片；

8. 脫蠟不充分；

9. 二抗與標本的內源性組織蛋白有交叉反應。

染色弱陽性

1. 固定方式不當或固定時溫度過高，影響到抗原的數(shù)量和質量；

2. 不適當?shù)目乖迯头绞�，抗原決定簇暴露不足；

3. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間不足；

4. 孵育抗體前切片上遺留了過多的沖洗液；

5. 孵育時切片未放置水平，導致抗體孵育不均勻。

信號定位與預測不符的原因

1. 組織固定不及時，抗原擴散移位；

2. 抗體選擇錯誤；
3. 膜蛋白核質染色：抗原修復過長，導致細胞膜破壞，膜蛋白轉移。

WB結果常見問題分析

1. 無條帶：抗體用錯，轉膜出錯，抗原無表達，試劑失效等；

2. 細微弱帶：上樣量少，抗體濃度低，ECL發(fā)光液失效等；

3. 高背景：封閉不夠，一抗?jié)舛雀�，洗膜不充分�?/span>

4. 非特異性條帶：抗體特異性差，也可能樣品量大，抗體濃度高；

5. 條帶出現(xiàn)邊緣規(guī)則的白圈：轉膜時膜和膠之間有氣泡；

6. 條帶中間出現(xiàn)白色：高濃度HRP把底物消耗過快后不發(fā)光；

7. 膜上很多黑點：膜上雜質與抗體非特異結合，洗膜充分，封閉液混勻；

8. 條帶拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗體孵育時間長，濃度高等；

9. 出現(xiàn)非均一性背景：洗抗體和發(fā)光時膜出現(xiàn)風干情況；

10. 條帶彎曲不平整：膠配置不均勻，膠中有氣泡雜質，玻璃板沒洗干凈，電流不均一等；

11. 條帶蛋白分子量偏高/偏低：分離膠濃度選擇不恰當，蛋白質降解；

12. 所有條帶練成片：上樣量大或電泳中途停止過長，樣品彌散。

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