欧美三级欧美成人高清,麻豆网神马久久人鬼片,男同gay自慰网站,欧美日韩精品一区二区三区激情,在线,男人的天堂av

Elisa實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)

Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷

定量測定

ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線點(diǎn)的吸光度可接近2.0，繪制時(shí)常用半對數(shù)紙，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是*理想的檢測區(qū)域。

定性測定

定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出\\\"有\(zhòng)\\"或\\\"無\\\"的簡單回答，分別用\\\"陽性\\\"、\\\"陰性\\\"表示。\\\"陽性\\\"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng)。\\\"陰性\\\"則為無反應(yīng)。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強(qiáng)度，其實(shí)質(zhì)仍是一個(gè)定性試驗(yàn)。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽性反應(yīng)的稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽性、弱陽性更具定量意義。

在間接法和夾心法ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。

（1） 間接法和夾心法

這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后常可出現(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗(yàn)的條件不同而異，因此實(shí)驗(yàn)中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物（見3.6）。在用肉眼判斷結(jié)果時(shí)，更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。

目視法簡捷明了，但頗具主觀性。在條件許可下，應(yīng)該用比色計(jì)測定吸光值，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample，S）、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值，然后進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。

a． 陽性判定值

陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。

用此法判斷結(jié)果要求實(shí)驗(yàn)條件十分恒定，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器，并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測而得到的�，F(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后，先計(jì)算陰性對照A值的平均數(shù)（NCX）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例0.400），試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX，并≤1.5×NCX，如其中超出此范圍，則棄去，而已另兩個(gè)陰性對照重新計(jì)算NCX；如有兩個(gè)陰性對照A值超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：

陽性判定值=NCX+0.05

標(biāo)本A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用。

根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生\\\"試驗(yàn)無效\\\"的后果。

b.標(biāo)本/陰性對照比值

在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本（S）和陰性對照（N）的A值后，計(jì)算S/N值。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性（positive），而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解。為避免混淆，更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用。實(shí)際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實(shí)驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值），則按0.05計(jì)算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

（2）競爭法

在競爭法ELISA中，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量，一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間，此時(shí)反應(yīng)*為敏感。

競爭法ELISA不易用自視判斷結(jié)果，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測定，讀出S、P和N的吸光值。計(jì)算方法主要也有兩種，即陽性判定值法和抑制率法。

a. 陽性判定值法

與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計(jì)算公式中引入陽性對照A值，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后，先計(jì)算陰性對照A值的平均值（NCX）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX），兩個(gè)平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個(gè)特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗(yàn)才有效。3個(gè)陰性對照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中超出此范圍，則棄去，而以另2個(gè)陰性對照重新計(jì)算×NCX；如有2個(gè)陰性對照A超出以上范圍，則該次實(shí)驗(yàn)無效。陽性判定值按下式計(jì)算：

陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX

標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性，A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性。

b. 抑制率法

抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計(jì)算：

抑制率（%）= （陰性對照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對照A值

一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。

更多

更多Elisa操作技術(shù)，分裝/原裝Elisa試劑盒價(jià)格，標(biāo)準(zhǔn)品對照品，抗體抗原

原創(chuàng)作者：杭州旺森科技有限公司