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聯(lián)系人：王宇豪
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你已經(jīng)是個成熟的細胞了，該學會自己做實驗了
實驗室里大家都埋頭做實驗，可為什么老板每次都罵我們，你都快 30 的人了這也不會那也不會，白長這么大了，栽培了你那么多年到頭來啥也指望不上。對此，我深感委屈，那個細胞我養(yǎng)了那么久，它還是那樣衣來伸手飯來張口，我有怪過誰么？
首先，這么大的細胞了，除了要自己學會傳代之外，鄙人對你們還有更高的要求，你該學會自己做實驗了。
來，先跟我說說細胞系和細胞株的區(qū)別。
細胞：原代培養(yǎng)物經(jīng)過次傳代成功的細胞就是細胞系，可泛指一般可能傳代的細胞。而通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標志物的培養(yǎng)物稱為細胞株，也就是說，細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。
簡而言之，細胞系概念強調(diào)細胞系是傳代成功后的細胞群，細胞株概念強調(diào)細胞群的純度，認為細胞株是克隆的結(jié)果。
那再來說說，什么是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染。
細胞：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，就是進入細胞的質(zhì)粒整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。瞬時轉(zhuǎn)染表達時間短暫，外源基因?qū)胝匣蚪M的幾率非常低，絕大部分以游離形式存在，不能隨細胞分裂而一同復制，導致后拷貝數(shù)被稀釋，無法達到持續(xù)表達外源基因的目的。一般用轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，多是瞬時轉(zhuǎn)染。
非常好，你能區(qū)分什么時候需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株嗎？
細胞：需要構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株的，有這些類型：
1. 長期在目的細胞中研究基因功能；
2. 部分蛋白半衰期極長，瞬時 RNA 只能干擾表達，無法去除已經(jīng)表達的目的蛋白，想要實現(xiàn)更好的基因干擾效果；
3. 想要實驗更，篩選拷貝數(shù)適量的細胞進行實驗研究；
4. 需要用誘導表達系統(tǒng)的，主要是一些致死基因或者是需要時空表達的；
5. 需要用細胞做動物實驗的，比如裸鼠成瘤等。
以下實驗就不需要構(gòu)建穩(wěn)定株：
1. 希望迅速觀察目的基因過表達或者干擾效果；
2. 2～4 天的瞬時表達已經(jīng)可以達到具體的實驗目的，比如檢測兩個外源轉(zhuǎn)染的目的蛋白之間的相互作用；
3. 細胞個體差異對實驗結(jié)果有影響。
那再來跟我匯報下什么是基因過表達、干擾或基因敲除？應該怎么選擇？
細胞：過表達就是把基因上調(diào)表達，即該基因被過度的轉(zhuǎn)錄、翻譯，終基因表達產(chǎn)物超過正常水平。做過表達要比做干擾難度高一些，過表達需要表達出長鏈的 mRNA，這一點比較困難，而干擾只需表達出短片段的 shRNA 即可。
一般情況下，如果本身就是高表達，你再做過表達就比較困難，某種程度上干擾更為重要，想說明一個基因?qū)τ谝粋�事件是必須的，只有把它拿掉，事件終止（或程度減弱），才比較有說服力。但是，如果你的基因在細胞中基礎(chǔ)表達本身就不高的話，還是有必要來選擇過表達實驗來對其表型進行驗證的，否則實驗會受到質(zhì)疑。
關(guān)于下調(diào)基因表達，一般來說干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株能滿足實驗所需。但是，干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株不能控制 shRNA 插入染色體的位置，染色體上的 shRNA 有時會丟失，另外 shRNA 也有脫靶效應，可能干擾了其他未知基因。還有就是，shRNA 是與目的基因的 mRNA 作用而使之降解，是在 RNA 水平上的降低目的基因的表達。
此時，基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株可以很大程度上規(guī)避這個問題。因為基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株是在基因組水平上通過基因序列的改變使其基因功能喪失，在敲除細胞中通常不會檢測到靶蛋白的表達，而且敲除效果穩(wěn)定，不能恢復，也就是yong久性敲除了。但是基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株缺點是操作周期長，費用多，效率低。如何選擇基因下調(diào)表達的方式，就要綜合考慮了。
那么同樣是穩(wěn)定株，單克隆？混合克�。恳趺催x？
細胞：當需要去除細胞群體干擾因素的時候，推薦使用單克隆穩(wěn)定細胞株，其基因組背景相對單一，對實驗結(jié)果干擾因素小。當進行系統(tǒng)生物學研究時，需考慮細胞群體因素，同時也是由于不同細胞個體差異大，而且不同整合位點的單克隆細胞株表現(xiàn)出來的細胞行為可能不一致，所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。因此，選擇單克隆細胞株還是混合克隆細胞株，需要根據(jù)實驗目的而定。
好極了，怎么判別篩選的穩(wěn)定株是單克隆呢？
細胞：如果外源片段含有熒光標記，可以直接使用流式細胞儀檢測其熒光是否均一；如果還有其它標簽，可以進行免疫熒光標記，再使用流式細胞儀觀察熒光分布是否出現(xiàn)均一峰值；
如果外源片段不含任何標簽或者熒光標記，則可以使用分子生物學比如 Southern Blot 的方法鑒定； 還可使用 96 孔板稀釋法篩選，得到的陽性克隆一般是單克隆。
