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胰酶分離提取，進(jìn)口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法
進(jìn)口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結(jié)晶。
本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結(jié)晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結(jié)晶的操作技術(shù)。同時為親和層析、免疫學(xué)實驗準(zhǔn)備實驗樣品。
1、胰蛋白酶原的提取與分離：稱取1－1.5Kg新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結(jié)締組織，在低溫下用絞肉機(jī)絞碎胰臟(或用高速組織勻漿機(jī)搗碎)加1－2倍體積以預(yù)冷卻的PH2.5-3.0乙酸酸化水溶液提取(按1g組織相當(dāng)于1ml體積計算，以此類推)。檢查提取液中PH，若高于PH3.0時應(yīng)及時用10％乙酸調(diào)節(jié)，使提取液維持PH2.5－3.0之間。在冷室5℃左右攪拌提取18－24h，而后用4層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約300mlpH2.5乙酸酸化水再提取殘渣一次(時間約為1－2h)，合并濾液，此時濾液PH值較高，可用5M H2PO4溶液調(diào)整PH至2.5－3.0，放置 3－5h后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進(jìn)行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。
2、鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進(jìn)行鹽析，使溶液至75％飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用4000r/min離心機(jī)離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，可得約20g胰蛋白酶原粗制品。
3、胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用10倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出1ml溶液用于測定，溶液中硫酸銨得含量(約為濾餅重得1/4)。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結(jié)合，生成硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細(xì)的固體CaCL2慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用5MNaOH溶液調(diào)PH至8.0。在酶溶液加入約5mg結(jié)晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置5℃冰箱中使酶原活化。
4、純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用5M硫酸溶液調(diào)節(jié)濾液PH至2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約1000ml，加入已經(jīng)研細(xì)的硫酸銨粉末，使其溶液達(dá)40％飽和度(每升濾液加242g硫酸銨)。放置5℃冰箱中5－8h,抽濾除去沉淀。
