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化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜法研究蛋白質(zhì)動態(tài)新途徑
近日，我所董夢秋實驗室與武漢物理與數(shù)學(xué)研究所唐淳實驗室合作者成功探索了利用化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, or CXMS）和結(jié)構(gòu)計算來研究蛋白質(zhì)動態(tài)的新途徑，并發(fā)布了通用流程。
到目前為止，結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究主要關(guān)注蛋白質(zhì)的基態(tài)結(jié)構(gòu)，但是蛋白質(zhì)行使功能往往需要在基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間轉(zhuǎn)變構(gòu)象。解析蛋白質(zhì)的激發(fā)態(tài)構(gòu)象和動態(tài)結(jié)構(gòu)對于X射線晶體學(xué)和電鏡等傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法是一大難題。核磁共振（NMR）雖然適合研究蛋白質(zhì)在溶液中的多種構(gòu)象，但是僅限于 50 kDa 以下的蛋白，而且需要大量的高度純化的蛋白。
董夢秋實驗室一直從事化學(xué)交聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) CXMS 的開發(fā)和應(yīng)用（Yang B, Nature Methods 2012; Lu S, Nature Methods 2015; Tan D, eLife 2016）。蛋白樣品中兩個氨基酸之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，必須滿足交聯(lián)劑的化學(xué)特異性要求（如氨基特異性）以及空間距離小于或等于交聯(lián)劑臂長的要求。因此，由 CXMS 獲得的交聯(lián)位點(diǎn)對提供了可用于結(jié)構(gòu)計算的距離約束信息。作為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的新工具，特別是單分子電鏡技術(shù)的輔助工具，CXMS 在很多大型蛋白質(zhì)復(fù)合體的結(jié)構(gòu)解析中做出了貢獻(xiàn)。但是，這個技術(shù)還存在一些問題，其中*令人困擾的是：即便用*嚴(yán)苛的篩選標(biāo)準(zhǔn)，總有小部分交聯(lián)位點(diǎn)對在晶體結(jié)構(gòu)（一般是基態(tài)構(gòu)象）中的距離大于交聯(lián)劑臂長（"over-length" chemical cross-links）。對于此類數(shù)據(jù)，大部分實驗室選擇丟棄或者放松距離約束（如果結(jié)構(gòu)未知）。本文兩個實驗室一年前合作發(fā)現(xiàn)，分子間的高可信度過長交聯(lián)反映了蛋白 - 蛋白間的弱（或瞬時）相互作用（Gong Z, Biophysics Reports 2015）。本文重點(diǎn)研究了蛋白內(nèi)不同結(jié)構(gòu)域之間的相對運(yùn)動。實驗結(jié)果表明，分子內(nèi)的高可信度過長交聯(lián)來源于蛋白質(zhì)的激發(fā)態(tài)構(gòu)象；它們不是制造麻煩的問題數(shù)據(jù)，而是 “眾里尋他千百度” 的反映蛋白質(zhì)動態(tài)的珍貴信息。
作者通過交聯(lián)數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)計算發(fā)現(xiàn)，結(jié)合了鈣離子但沒有結(jié)合配體肽段或蛋白的鈣調(diào)蛋白（Ca2+-CaM） 除了采取啞鈴狀的開放態(tài)構(gòu)象（基態(tài)），還有一種閉合態(tài)構(gòu)象，非常接近之前用 NMR 手段觀察到的激發(fā)態(tài)構(gòu)象。這種閉合態(tài)構(gòu)象與結(jié)合了各種配體的 Ca2+-CaM 的晶體結(jié)構(gòu)或 NMR 結(jié)構(gòu)也非常相似，說明配體肽段或蛋白的結(jié)合穩(wěn)定了原已存在的 Ca2+-CaM 的閉合態(tài)構(gòu)象。本文還用同樣方法研究了細(xì)菌磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中的蛋白 EIN 和谷氨酰胺結(jié)合蛋白 QBP，發(fā)現(xiàn)它們均含有基態(tài)構(gòu)象之外的一種激發(fā)態(tài)構(gòu)象。
本文建立了一套基于交聯(lián)數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)模擬計算方法，內(nèi)容包括：用 15N 同位素標(biāo)記的蛋白與相對應(yīng)的天然同位素標(biāo)記的蛋白等量混合后進(jìn)行交聯(lián)質(zhì)譜分析，從中得到高可信度的分子內(nèi)交聯(lián)數(shù)據(jù)，然后采用專門開發(fā)的 DynaXL 軟件進(jìn)行構(gòu)象模擬計算。DynaXL 包含結(jié)構(gòu)域識別、模擬交聯(lián)反應(yīng)、分子動力學(xué)模擬等多個模塊。它首先嘗試用基態(tài)構(gòu)象模擬交聯(lián)反應(yīng)，如果不能滿足全部交聯(lián)約束，則添加一個構(gòu)象，直到所有交聯(lián)約束都得以滿足。同類其它算法只考慮單一構(gòu)象，試圖讓單個構(gòu)象滿足所有交聯(lián)數(shù)據(jù)；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在溶液中存在多種構(gòu)象時，容易造成過擬合，得到錯誤結(jié)構(gòu)。
已發(fā)表的 NMR 研究表明，Ca2+-CaM 的激發(fā)態(tài)構(gòu)象在溶液中所占的比例小于 5%；EIN 和 QBP 的激發(fā)態(tài)構(gòu)象很可能由于豐度過低未能被 NMR 檢測到。這說明 CXMS-DynaXL 方法可以靈敏地檢測到溶液中的低豐度構(gòu)象，靈敏度達(dá)到甚至超過 NMR，且不受蛋白大小限制，可以廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)動態(tài)變化研究。
