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蛋白質(zhì)活性測(cè)定:脂肪氧化酶活性測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：259 發(fā)布時(shí)間：2019/3/5
各位同學(xué)，本人前些日子做了脂肪氧化酶活性測(cè)定的工作，遇到了一些問(wèn)題，想在這里向大家請(qǐng)教，希望大家能不吝賜教，來(lái)幫助我解脫心中的迷惑。
本人是做植物材料的，從葉片中提取粗蛋白，0.5g葉片使用液氮研磨，加入到4ml冰預(yù)冷提取緩沖液（0.05mol/L PH6.4 磷酸鈉緩沖液，1mmol/L EDTA，1%PVP，1mmol/LDTT）中，12，000g，4℃離心10min，取上清進(jìn)行脂肪氧化酶酶活性分析。
通過(guò)檢測(cè)234nm光吸收（Beckman DU800, Beckman）來(lái)測(cè)定脂肪氧化酶活性，底物溶液配制：280mg亞油酸，280mgTween-20加入到8mL雙蒸水中，上下顛倒混勻，加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加雙蒸水定容到50mL，-70℃保存?zhèn)溆?Huang, et al. 2005)。2mL反應(yīng)體系包括：1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸鈉緩沖液，50μL底物溶液，20μL酶粗提液，同時(shí)設(shè)立不加酶的空白對(duì)照，25℃反應(yīng)3min，記錄234nm光吸收變化。
實(shí)驗(yàn)方法就是上面所說(shuō)的，但是遇到了幾個(gè)問(wèn)題。
1.在不加入粗蛋白的情況下，234nm光吸收持續(xù)上升，我覺(jué)得可能是亞油酸在空氣中氧化造成的，我又無(wú)力避免。
2.采用不同PH的緩沖液，不加粗蛋白的情況下，234nm光吸收上升的速率不同，PH越高234nm光吸收上升速率就越緩慢。
3.在加入粗蛋白后，234nm光吸收不升反降，在3分鐘后才又上升。
這樣一來(lái)我測(cè)酶活反應(yīng)基本不可能，我覺(jué)得可能是我測(cè)酶活的反應(yīng)體系出了問(wèn)題，在測(cè)原核表達(dá)后的酶活性該體系還馬馬虎虎，在PH6.4時(shí)的確還是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些，但是從葉片中提取的粗蛋白就不能測(cè)出來(lái)酶活性了。
在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)我還想做酶反應(yīng)后的產(chǎn)物的HPLC分析，如此強(qiáng)的本底反應(yīng)讓我不知道還要不要做下去，我的方法是克隆一篇文獻(xiàn)的方法，這里我不是懷疑人家工作的真實(shí)性，我想可能還是我愚鈍。
[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797
各位兄臺(tái)，給我出出主意吧，基因克隆出來(lái)，原核表達(dá)也還不錯(cuò)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)卡在*后，雖然原核表達(dá)后有一些酶活性，但是總是覺(jué)得反應(yīng)體系不是很好，試驗(yàn)不是很穩(wěn)定，想進(jìn)一步做些酶學(xué)分析，這樣的體系真是不可靠。
本人是做植物材料的，從葉片中提取粗蛋白，0.5g葉片使用液氮研磨，加入到4ml冰預(yù)冷提取緩沖液（0.05mol/L PH6.4 磷酸鈉緩沖液，1mmol/L EDTA，1%PVP，1mmol/LDTT）中，12，000g，4℃離心10min，取上清進(jìn)行脂肪氧化酶酶活性分析。
通過(guò)檢測(cè)234nm光吸收（Beckman DU800, Beckman）來(lái)測(cè)定脂肪氧化酶活性，底物溶液配制：280mg亞油酸，280mgTween-20加入到8mL雙蒸水中，上下顛倒混勻，加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加雙蒸水定容到50mL，-70℃保存?zhèn)溆?Huang, et al. 2005)。2mL反應(yīng)體系包括：1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸鈉緩沖液，50μL底物溶液，20μL酶粗提液，同時(shí)設(shè)立不加酶的空白對(duì)照，25℃反應(yīng)3min，記錄234nm光吸收變化。
實(shí)驗(yàn)方法就是上面所說(shuō)的，但是遇到了幾個(gè)問(wèn)題。
1.在不加入粗蛋白的情況下，234nm光吸收持續(xù)上升，我覺(jué)得可能是亞油酸在空氣中氧化造成的，我又無(wú)力避免。
2.采用不同PH的緩沖液，不加粗蛋白的情況下，234nm光吸收上升的速率不同，PH越高234nm光吸收上升速率就越緩慢。
3.在加入粗蛋白后，234nm光吸收不升反降，在3分鐘后才又上升。
這樣一來(lái)我測(cè)酶活反應(yīng)基本不可能，我覺(jué)得可能是我測(cè)酶活的反應(yīng)體系出了問(wèn)題，在測(cè)原核表達(dá)后的酶活性該體系還馬馬虎虎，在PH6.4時(shí)的確還是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些，但是從葉片中提取的粗蛋白就不能測(cè)出來(lái)酶活性了。
在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)我還想做酶反應(yīng)后的產(chǎn)物的HPLC分析，如此強(qiáng)的本底反應(yīng)讓我不知道還要不要做下去，我的方法是克隆一篇文獻(xiàn)的方法，這里我不是懷疑人家工作的真實(shí)性，我想可能還是我愚鈍。
[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797
各位兄臺(tái)，給我出出主意吧，基因克隆出來(lái)，原核表達(dá)也還不錯(cuò)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)卡在*后，雖然原核表達(dá)后有一些酶活性，但是總是覺(jué)得反應(yīng)體系不是很好，試驗(yàn)不是很穩(wěn)定，想進(jìn)一步做些酶學(xué)分析，這樣的體系真是不可靠。
