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單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的最新進展盤點
SPLiT-seq：成本低至一美分
艾倫腦科學研究所的副主任Bosiljka Tasic指出，全基因組的單細胞分析目前很受歡迎。它讓人們了解整個系統(tǒng)中的單個組分，也就是單細胞。與PCR和原位雜交等技術(shù)不同，全基因組分析無偏向地告知了細胞正在表達什么，而不需要你去選擇分析什么。
現(xiàn)在有許多平臺和技術(shù)可用于制備測序用的單細胞RNA。這些技術(shù)大體是在微孔板的各個孔中分離單個細胞，或者使用微滴來充當單個細胞的反應(yīng)室。無論采用哪種方式，Tasic認為關(guān)鍵是在分析的某個時刻將細胞分離并添加條形碼，這樣才能將RNA序列分配到它們當初來源的那個細胞。
Bosiljka Tasic聯(lián)合華盛頓大學的Georg Seelig團隊開發(fā)出一種稱為SPLiT-seq的技術(shù)，其中細胞本身作為反應(yīng)室。這種技術(shù)將細胞或細胞核固定，以便捕獲RNA，不過洗滌試劑可以進進出出。通過一系列合并和分離的步驟，它開展逆轉(zhuǎn)錄并連接條形碼標簽，*終進行裂解和PCR（使用條形碼引物）。
SPLiT-seq技術(shù)于今年3月發(fā)表在《Science》雜志上。據(jù)Tasic介紹，這是一種低成本的技術(shù)，每個細胞的建庫成本低至一美分（約合人民幣七分錢），大大降低了實驗室開展單細胞分析的門檻。“真正強大的是它幾乎無需任何特殊儀器，”Tasic補充說。
研究團隊利用SPLiT-seq技術(shù)對出生后第2天和第11天小鼠大腦和脊髓組織的細胞核進行分析。他們成功地鑒定出100多種細胞類型，其基因表達模式與細胞功能、區(qū)域特異性和分化階段相對應(yīng)。這些數(shù)據(jù)可用于創(chuàng)建基因表達圖譜，與艾倫研究所的其他參考圖譜互補。
snDrop-seq：單核RNA測序
加州大學圣地亞哥分校的張鹍（Kun Zhang）團隊則關(guān)注人體組織的單細胞分析。“你需要將細胞彼此分離，才能開展各種單細胞分析，”他說。不過，大腦組織很難解離，“這就使結(jié)果存在很大的偏向性，因為有些細胞分離，而有些細胞則彼此相連。相比之下，提取完整的細胞核則相對簡單”。
他們采用了一種經(jīng)過改進的snDrop-seq方案，希望破壞微滴中的核膜，并盡量避免RNA降解。“常規(guī)的Drop-seq或10X Genomics方案不行，因為膜不會破裂，”張鹍解釋說。目前有幾種方法可以完成這項任務(wù)，比如改變微流體芯片，讓核膜在機械力作用下分解。“我們實際上提高了溫度來破壞核膜。”
他們同時開展了snDrop-seq和scTHS-seq，后者為染色質(zhì)開放性檢測。“這使得我們能夠在RNA水平和染色質(zhì)水平上比較這些單細胞，”張鹍指出。他們能夠重建各種腦細胞的表觀遺傳圖譜，并利用單細胞多組學方法將風險因素與特定的細胞類型相關(guān)聯(lián)，了解神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞對阿爾茨海默病、自閉癥或精神分裂癥等病的貢獻。
Smart-seq2：處理少量樣本
Wellcome Sanger研究所的Adam Reid及其同事想要了解瘧疾生命周期中的遺傳控制。 通過測序不同步的單細胞并分析轉(zhuǎn)錄組，他們發(fā)現(xiàn)寄生蟲階段的發(fā)育實際上有很大的變化。“如果對大量RNA進行測序，這一點并不明顯，”研究人員談道。
他們對低通量的Smart-seq2方案進行了修改，目標是分析每個階段的100個細胞。 Reid表示，與高通量的10X Genomics或Drop-seq平臺相比，“你可以獲得更多關(guān)于哪些基因表達以及表達豐度如何的信息”。
引起瘧疾的瘧原蟲非常小，含有極少量的RNA，并且基因組偏向性非常明顯，GC含量 低至20％，而哺乳動物大約是35-40％。因此，建庫的試劑往往不能很好地發(fā)揮作用，不過通過增加PCR循環(huán)次數(shù)和嘗試不同的酶，研究人員還是很好地解決了這一問題。
生物信息學工具：ASAP
人們也許會對scRNA-seq望而卻步，因為需要購買復雜的儀器和掌握生物信息學流程。有時，生物學家和信息學家之間的溝通“非常糟”，瑞士生物信息學研究所的負責人Bart Deplancke回憶說。在準備開展脂肪組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組學研究時，他們有許多數(shù)據(jù)集需要處理，卻發(fā)現(xiàn)其合作者往往無法開展。
于是，他們著手安排合作，讓兩類研究人員能以更直觀的方式觀察和處理數(shù)據(jù)。他們開發(fā)出一個名為Automated Single-cell Analysis Pipeline（ASAP）的平臺。這是一個基于Web的完整流程，提供了標準工具，包括過濾、降維、聚類、差異表達和功能富集。它能夠與各種數(shù)據(jù)庫交互，并以2D或3D顯示結(jié)果。“對于每個步驟，我們都提供了基本教程，它將告訴你每種分析工具能做什么，”Deplancke說。
他指出，“即使是生物信息學家也很喜歡用，因為它能夠快速處理和查看數(shù)據(jù)。然后他們與生物學家一起觀察數(shù)據(jù)，提出一些新的假設(shè)，并通過實驗或計算手段來進一步證明它。”
