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[創(chuàng)新技巧]如何利用CRISPR改造植物基因組
如今，CRISPR技術(shù)已經(jīng)用于許多植物基因組的改造，包括著名的模式生物，如擬南芥和蒺藜苜蓿，以及重要的經(jīng)濟(jì)作物，如馬鈴薯、玉米、小麥、水稻和蘑菇等。盡管CRISPR系統(tǒng)在大多數(shù)物種中都通用，但涉及到植物細(xì)胞的編輯，還是不能一成不變。
Addgene的Joel McDade在此介紹了植物基因組的改造，突出了CRISPR系統(tǒng)針對植物的特定改變，并概括了科研人員的植物基因組編輯工具。
總的來說，之前的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)規(guī)則也適用于植物的基因編輯。不過，常用的CRISPR質(zhì)�？赡苄枰鲆恍└淖儯拍茉谥参锛�(xì)胞中起作用。與其他模式系統(tǒng)一樣，Cas9或Cas9變異體和單鏈向?qū)NA（gRNA）的表達(dá)就足以修飾植物的基因組。
與其他生物一樣，gRNA也是由~20個(gè)核苷酸的靶向序列和~75個(gè)核苷酸的支架序列組成，不過驅(qū)動(dòng)gRNA表達(dá)的啟動(dòng)子則取決于所使用的細(xì)胞類型。在植物細(xì)胞中，gRNA的表達(dá)可通過植物特異的RNA pol III啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)，如AtU6、TaU6、OsU6或OsU3。Addgene提供了30多種不含gRNA的骨架，方便你插入靶向序列，*快構(gòu)建好載體。
目前，研究人員已經(jīng)對一些Cas9變異體進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以加強(qiáng)在植物細(xì)胞中的翻譯。同時(shí)，他們也使用缺乏核酸酶活性的Cas9激活物（如dCas9-VP64）或阻遏物（dCas9-KRAB 或dCas9-SRDX）來激活或抑制植物細(xì)胞中的目標(biāo)基因。
Cas9表達(dá)通常是由植物來源的RNA pol II啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的。舉個(gè)例子，常用的RNA pol II啟動(dòng)子包括花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子（CaMV 35S）或泛素啟動(dòng)子。Addgene也提供了含有Cas9的質(zhì)粒，可用于目標(biāo)基因的敲除、激活和抑制。之前提到的許多不含gRNA的骨架也包含Cas9，可同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA。
將這些組分導(dǎo)入植物細(xì)胞
一旦萬事俱備，下一步就是將CRISPR組分導(dǎo)入細(xì)胞了。記住，這些組分的高效導(dǎo)入對任何實(shí)驗(yàn)而言都是至關(guān)重要的，若gRNA或Cas9表達(dá)失敗，結(jié)果肯定不樂觀。CRISPR組分可瞬時(shí)表達(dá)，也可穩(wěn)定表達(dá)，這取決于導(dǎo)入方法和細(xì)胞類型。
你可以選擇用PEG（聚乙二醇）來導(dǎo)入CRISPR組分并瞬時(shí)表達(dá)，但這種方法僅限于原生質(zhì)體細(xì)胞，也就是細(xì)胞壁被去除的植物細(xì)胞。你也可以選擇農(nóng)桿菌介導(dǎo)的導(dǎo)入，它利用農(nóng)桿菌作為載體，將你感興趣的基因?qū)肽康募?xì)胞。Johannes Stuttmann實(shí)驗(yàn)室提供了pDGE Dicot Genome Editing Kit，包含了各種帶有Cas9且與農(nóng)桿菌兼容的載體。
對于植物的基因組改造，盡管許多細(xì)節(jié)不同，如啟動(dòng)子、蛋白序列或轉(zhuǎn)染方法，但基本原理還是與其他系統(tǒng)無異。目前已經(jīng)有很多文獻(xiàn)發(fā)表，也有很多工具出現(xiàn)，因此你完全不必?fù)?dān)心。大膽地去試試吧。
