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干貨來襲：ELISA實驗常見問題

點擊次數(shù)：322 發(fā)布時間：2018/8/8

ELISA以靈敏度較高、特異性較好的特點在科研及臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但操作中的各個環(huán)節(jié)對試驗的檢測效果影響較大，如不注意，也會導(dǎo)致諸多問題。


1.標(biāo)曲和樣本都不顯色


   在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸，導(dǎo)致顯色偏弱。推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調(diào)至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結(jié)合效果。


   如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手，一定要做好標(biāo)記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。


2.標(biāo)曲有顯色，樣本卻不顯色


   遇到這種情況，很多人覺得是試劑盒問題，這其實是一個誤區(qū)。任何一種實驗方法，都有其局限性，當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng)，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度的方法，與不同技術(shù)結(jié)合后，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。如采用信號增強(qiáng)劑的高敏ELISA、ECL為底物的化學(xué)發(fā)光ELISA、采用熒光法檢測的ELISA、結(jié)合PCR擴(kuò)增的免疫PCR等等。


   對于目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，并使結(jié)果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，甚至低于標(biāo)準(zhǔn)品濃度的S5點，雖然可以計算得到數(shù)值，但實際上這個數(shù)值的可信度已經(jīng)降低了。而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi)，得到的數(shù)值也更加可信。需要指出的是，國內(nèi)某些所謂的高敏ELISA試劑盒，并沒有采用信號增強(qiáng)劑的方法，而只是簡單地提高了抗體濃度，較普通ELISA其靈敏度的提升有限。


   還有人覺得，為什么用其它廠家的試劑盒可以測到樣本值，而我們的就是測不到呢？這里就涉及到回收率這個概念了，詳細(xì)的闡述下次有機(jī)會可以跟大家再聊一聊。簡單來說，回收率就是樣本的真實值和理論值之間的比值，優(yōu)秀試劑盒的這個數(shù)值在80 – 120%之間。與回收率相關(guān)的試劑就是試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。篩選出合適的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，使目的蛋白含量接近的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本顯色速度相似，那么計算得到的樣本值也會比較接近真實值。要想測到樣本值并不是很難，只要選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，壓低標(biāo)曲的本底，自然就會計算得到樣本值，然而這樣的樣本值并不真實，對于科研來說沒有太大的參考意義。


3.標(biāo)曲不顯色或者顯色很弱，樣本有顯色


   溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。標(biāo)準(zhǔn)品溶解時，需要渦旋震蕩，以保證充分溶解。在做倍比稀釋時，也要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打，效率較低、效果也不一定*佳。


4.標(biāo)曲和樣本都顯色，但復(fù)孔的CV比較大


   這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范，就會造成移液的誤差較大。實驗者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。個人的操作可以在空白板上練習(xí)移液動作，或者在幾十個離心管中加入相同體積的水，通過電子天平稱量，檢驗移液的精密度。同時還需練習(xí)加快加樣速度，減少從個樣本到*后一個樣本加樣時間過長導(dǎo)致的差異。


5.樣本通過不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異比較大


   有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應(yīng)該如何稀釋，那么我們就會做下預(yù)實驗，確定稀釋倍數(shù)。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋后，計算得到的樣本值之間差異較大，應(yīng)該選擇哪一個稀釋倍數(shù)呢？


   這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當(dāng)某兩個梯度稀釋后，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本，經(jīng)過多倍稀釋后，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。


6.本底偏高，樣本值都測不到


   標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導(dǎo)致無法測到樣本值。


   在加入TMB顯色后，需實時觀察標(biāo)曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色，即可終止反應(yīng)。


7.同一樣本使用不同廠家的ELISA試劑盒檢測，計算得到的樣本值差異較大


   這里涉及到另一個評估試劑盒性能的參數(shù)——校準(zhǔn)。不同廠家采用的標(biāo)準(zhǔn)品可能有所不同，對其定量的方法和標(biāo)準(zhǔn)也不同，這就是企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此哪怕是同一個標(biāo)準(zhǔn)品，在不同廠家各自的實驗條件下測定，結(jié)果可能也會差異很大。


   因此，我們并不建議將不同廠家的結(jié)果進(jìn)行對比，除非他們都是用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了校準(zhǔn)。然而，并非所有蛋白都有標(biāo)準(zhǔn)品，因此使用不同廠家的產(chǎn)品計算的樣本值差異較大的現(xiàn)象也在所難免。但都用同一廠家的試劑盒檢測樣本，那么結(jié)果還是可以進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析的。



 

   在實際操作中，除了選擇優(yōu)良試劑外，必須嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行操作，同時作好室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評，以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ髯黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本，才能保證檢測質(zhì)量。


 

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