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JM109化學(xué)感受態(tài)細胞的操作方法
點擊次數(shù)：353 發(fā)布時間：2018/7/31
遠慕生物生產(chǎn)的JM109感受態(tài)細胞是采用大腸桿菌JM109菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化使用pUC19質(zhì)粒檢測，轉(zhuǎn)化效率可達108，-70℃保存幾個月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。
基因型：recA supE44 endA1 hsdR17 gyrA96relA1 thi Δ(lac-proAB) F’[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]
特 點：一種琥珀抑制型F’重組缺陷菌株。支持M13噬菌體載體的生長，對轉(zhuǎn)染的DNA有修飾作用，但無限制作用。該菌株中的F’帶有l(wèi)acZΔM15，后者使得與在λZAP中編碼的β-半乳糖 苷酶氨基端進行α-互補，可用于藍白斑篩選。
操作方法：（以下各步驟均為無菌操作）
1、將感受態(tài)細胞置于冰上融化，以下實驗以100ul感受態(tài)細胞為例。
2、向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA，注意目的DNA的體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2-3分鐘，注意不要搖動離心管。
4、向離心管中加入500ul無菌無抗的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)1小時。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達，使菌體復(fù)蘇。
5、取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布含相應(yīng)抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取100ul左右轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如果轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過多菌液可以抑制細菌生長。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事項：
1、收到感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會降低。
2、實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，防止其它DNA的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。
3、轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時DNA體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分。
4、轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量
5、為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失將到。
基因型：recA supE44 endA1 hsdR17 gyrA96relA1 thi Δ(lac-proAB) F’[traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]
特 點：一種琥珀抑制型F’重組缺陷菌株。支持M13噬菌體載體的生長，對轉(zhuǎn)染的DNA有修飾作用，但無限制作用。該菌株中的F’帶有l(wèi)acZΔM15，后者使得與在λZAP中編碼的β-半乳糖 苷酶氨基端進行α-互補，可用于藍白斑篩選。
操作方法：（以下各步驟均為無菌操作）
1、將感受態(tài)細胞置于冰上融化，以下實驗以100ul感受態(tài)細胞為例。
2、向感受態(tài)細胞懸液中加入需轉(zhuǎn)化的目的DNA，注意目的DNA的體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴放置30分鐘。
3、將離心管置于42℃水浴中放置60-90秒，然后快速轉(zhuǎn)移到冰浴中放置2-3分鐘，注意不要搖動離心管。
4、向離心管中加入500ul無菌無抗的SOC或LB培養(yǎng)基，37℃ 180rpm振蕩培養(yǎng)1小時。目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達，使菌體復(fù)蘇。
5、取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞涂布含相應(yīng)抗生素的SOC或LB平板，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時。涂布用量可根據(jù)具體實驗來調(diào)整，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取100ul左右轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板；反之，如果轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂板。過多菌液可以抑制細菌生長。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心后吸除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。涂布剩余的菌液可4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的平板。
注意事項：
1、收到感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會降低。
2、實驗過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，防止其它DNA的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。
3、轉(zhuǎn)化時，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時DNA體積要小于感受態(tài)細胞體積的十分。
4、轉(zhuǎn)化率的計算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA總量
5、為防止轉(zhuǎn)化實驗不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失將到。
