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質(zhì)粒提取步驟

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文件大�。�28kb

上傳時間：2019/4/15 17:13:31

文件類型：doc

上 傳 者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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一、實(shí)驗(yàn)原理：
        堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線性染色體DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，共價閉環(huán)質(zhì)粒DNA 的氫鍵會被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤繞，仍會緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA 的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA 的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性就不會那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA ，蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
 
二、操作步驟：
        1. 準(zhǔn)備20ml滅菌過的培養(yǎng)管，編號，分別加入8ml LB培養(yǎng)基，再加入8µl 相應(yīng)抗生素，可適量多加；
        2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個菌落至培養(yǎng)管中，37℃震蕩過夜（274rpm）；
        3. 取2ml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，室溫10000rpm離心2min，去上清；（可重復(fù)步驟2，直至菌液離心完）（去上清時用紙吸一下）

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