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G418溶液(geneticin,20mgml)說明書

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上傳時間：2019/3/20 16:50:05

文件類型：doc

上 傳 者：上海遠慕生物科技有限公司

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操作步驟（僅供參考）： 
1、 由于每種細胞對G418的敏感性不同，而且不同批次的G418的活性液不同，所以在篩選之前，需要確定G418的*佳篩選濃度，一般在50～1000μg/ml范圍內(nèi)進行篩選。
2、 將細胞制備成細胞懸液，并稀釋到1000個/ml。 
3、 加入不同量的G418 solution (20mg/ml)，選擇在10~14天內(nèi)使細胞全部死亡的G418濃度來進行下一步的篩選試驗。
 
注意事項:
1、 盡量減少反復凍融的次數(shù)，以免失效。 
2、 基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)要一段時間才能表達出蛋白質(zhì), 所以篩選不能太早。
3、 篩選也不宜太遲，一般要在轉(zhuǎn)染24h之后才開始加G418篩選。因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，*終導致篩選不出陽性克隆。
4、 隨著細胞代謝，G418的濃度和活性都會下降，應(yīng)每3~5天更換一次含有G418的篩選液，這時藥物濃度可以降至200μg/ml。
5、 加藥篩選約5～7天左右，細胞會大量死亡，為了減少死亡細胞對陽性克隆的不利影響以及增加陽性克隆的得到率，可以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。加藥后，在高倍鏡下，刮除陰性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)�；蛘哂锰篆h(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一個新的孔中培養(yǎng)，*后再用有限稀釋法把陽性克隆在96孔板中篩選。
6、 一般經(jīng)過4周左右的篩選，得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。但是外源基因如果沒有整合到基因組中的話，目的基因還是很容易丟失的，再次篩選往往是必不可少的，經(jīng)過2次以的篩選之后才能找到遺傳穩(wěn)定的細胞克隆。 
7、 盡量避免污染。 
8、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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