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論遠(yuǎn)慕生物感受態(tài)的制備及注意事項(xiàng)

點(diǎn)擊次數(shù)：374 發(fā)布時(shí)間：2019/11/21 9:41:17

   感受態(tài)是指一種容易接受外源DNA的狀態(tài)。在轉(zhuǎn)基因的過(guò)程中，一般會(huì)把待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞處理成為感受態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化的效率。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化學(xué)試劑法）的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過(guò)的感受態(tài)細(xì)胞。

DH5a菌感受態(tài)的制備：

1、從LB平板上挑取DH5a單菌落,接種于3LB液體培養(yǎng)基中 37℃下振蕩培養(yǎng)12h左右直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期培養(yǎng)基中。

2、將菌懸液以1:100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再將菌懸液以1:100的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中37℃，210rpm至OD ＝0.5左右(生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期），約2-3h。

3、將菌液轉(zhuǎn)移到兩只預(yù)冷的50ml無(wú)菌離心管中，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。

4、每只離心管中加入4ml冰冷的0.1M CaCl2，使菌體重懸，冰浴30min，4℃、5000rpm離心5min，棄上清。

5、每只離心管中加入1ml冰冷的0.1M CaCl2，重懸后分裝到無(wú)菌的1.5ml離心管中(每管100µl)。

6、置-40℃冰箱長(zhǎng)期保存。

制備感受態(tài)的注意事項(xiàng)：

1、所有器具必須清潔干凈，避免污染。

2、培養(yǎng)基裝量建議不要高于培養(yǎng)基體積/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml，厭氧生長(zhǎng)出來(lái)的菌體是做不出效率高的感受態(tài)的。 

3、接種前的pH值在6.8-7.2。等菌搖好后，可以測(cè)一下pH值，不要低于6.0，在6.5以上。

4、經(jīng)驗(yàn)證明，當(dāng)培養(yǎng)基中存在一定量的Mg2+離子時(shí)，該方法制得的感受態(tài)要相對(duì)較高。在制備普通感受時(shí)，使用20mM MgCl2做為培養(yǎng)基的添加物，在感受態(tài)收獲之前20-30分鐘加入，會(huì)收到很好的效果。

5、較低的溫度培養(yǎng)有利于感受態(tài)的形成，這樣可以獲得較高的感受態(tài)，但太低又不實(shí)用，因而產(chǎn)生了Inoue的高效感受態(tài)制備方法。

6、在保存感受態(tài)時(shí)，DMSO要比甘油的效果要好，它會(huì)使感受態(tài)的效率增加。

7、液氮速凍也會(huì)使感受態(tài)的效率提高，因此推薦用液氮速凍感受態(tài)，然后保存于超低溫冰箱內(nèi)。

8、凍存的感受態(tài)用一次拿一管，不要反復(fù)凍融�；瘍鲋罅⒓词褂茫灰戏盘�。

9、操作時(shí)可以輕彈輕甩，盡量避免用移液器吹吸。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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