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DEAE—離子交換劑純化血清IgG使用步驟及注意事項(xiàng)
DEAE-纖維素（Diethylaminoethyl-cellulose，DEAE）是在纖維素上引入二乙基氨基乙基，屬于弱堿型陰離子交換劑。吸附蛋白質(zhì)的*適pH范圍為7～9，pH超過(guò)9.5，DEAE基團(tuán)則不解離帶電荷。每克DEAE含0.96～1.24mmol/L可解離基團(tuán)，與蛋白質(zhì)的交換量可75-122mg/100mgDEAE。
應(yīng)用離子交換劑來(lái)純化物質(zhì)，可以是把要純化的物質(zhì)成分交換吸附于離子交換劑上，然后再分別洗脫下來(lái)獲得純品，或者把不需要的成分吸附于離子交換劑上，需要的成分直接流出，得到純品。本實(shí)驗(yàn)采用DEAE-纖維素層析柱純化血清IgG，利用pH6.7的緩沖液溶解樣品IgG，此時(shí)IgG粗物中除IgG外，其他雜蛋白均帶上不同數(shù)量的負(fù)電荷，可以和DEAE上的陰離子發(fā)生交換吸附于柱上。IgG因不解離帶電，而不發(fā)生交換吸附，利用此特點(diǎn)，讓溶解后的樣品流過(guò)DEAE纖維素柱，即可直接收集到較純的IgG。
（一）試劑及器材
1. 0.0175mol/L， pH6.7，磷酸鹽緩沖溶液
2. 奈氏試劑。
3. 20%（W/V）磺基水楊酸溶液。
4. 1cm×50cm
5. 黑、白比色磁盤。
（二）操作步驟
1．活化
根據(jù)所需層析柱的柱床體積計(jì)算所需DEAE的用量，稱取所需DEAE用蒸餾水浸泡過(guò)夜，其間換幾次水，每次除去細(xì)小顆粒。抽干，改用0.5ml/L NaOH溶液浸泡1h以上，抽干（可用布氏漏斗），用無(wú)離子水漂洗，使pH至8左右（用pH試紙檢查）。再改用0.5ml/L HCl溶液浸泡1h以上，去酸溶液，用無(wú)離子水洗至pH6左右。然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液，浸泡平衡后使用。
2．裝柱
用0.0175mol/L，pH6.7，磷酸鹽緩沖溶液浸泡已處理好的DEAE-纖維素，并更換1～2次。然后攪拌均勻，灌入層析柱中，直至纖維素柱床高約17cm左右為止。柱床形成后，在洗脫瓶裝入0.0175mol/L pH6.7磷酸鹽緩沖溶液，接在層析柱上口，打開柱下端出口，使磷酸鹽緩沖溶液流過(guò)纖維素，直至流出液的pH值與磷酸鹽緩沖溶液的pH值完全相同（用pH試紙不斷檢查）為止。
3．上樣
上述平衡過(guò)程完畢后，關(guān)閉柱下口。用滴管吸去纖維素柱面上的深液（但不能低于柱下口），控制流速使樣品慢慢進(jìn)入纖維素內(nèi)。待全部樣品進(jìn)入柱后，在柱床面上加一層0.0175mol/L pH6.7 磷酸鹽緩沖溶液。
4．洗脫
連接洗脫瓶，打開柱下口開始洗脫�？刂屏魉贋�0.5ml/min， 用試管收集洗脫液，每管10滴。從每滴中取1滴收集液放入在黑色比色盤孔中，加入1滴20%磺基水楊酸檢查是否產(chǎn)生白色沉淀。在此條件下在收集液中首先出現(xiàn)的蛋白質(zhì)即為純化的IgG。因此，從洗脫開始就應(yīng)收集洗脫液，直至收集液中無(wú)蛋白質(zhì)出現(xiàn)為止（加磺酰水楊酸不呈白色沉淀），合并含有蛋白質(zhì)的各管收集液中無(wú)蛋白質(zhì)即為純化的IgG溶液。
5．再生
用過(guò)的離子交換劑可以反復(fù)使用，使其恢復(fù)原狀的方法俗稱“再生”。 由于DEAE-纖維素使用后因帶有大量雜蛋白，所以再生時(shí)，先用0.5ml/L NaOH浸洗，用無(wú)離子洗至pH8左右，然后用0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖溶液浸泡即可轉(zhuǎn)型再使用。
6．鑒定
純化后獲得的蛋白質(zhì)樣品均應(yīng)進(jìn)行鑒定后方能證明產(chǎn)品的合格性。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
