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手把手教你使用酸法提取組蛋白
近年來關(guān)于組蛋白的研究越來越多，組蛋白各種各樣的修飾有各種各樣的功能，想要做跟組蛋白相關(guān)的研究，組蛋白提取是一個(gè)必不可少的技能了。
你還在為組蛋白如何簡單方便的提取而煩惱么，來，讓學(xué)霸君教你一招。
組蛋白有四種類型：H2A、H2B、H3、H4，組蛋白是染色體基本結(jié)構(gòu)蛋白，因富含堿性氨基酸 Arg 和 Lys 而呈堿性，可與酸性的 DNA 緊密結(jié)合。因?yàn)榻M蛋白是偏堿性的，因此我們可以使用酸法來提取。
下面學(xué)霸君就仔細(xì)介紹一下實(shí)驗(yàn)操作步驟啦：
1、將 3-5×105 個(gè)細(xì)胞種到 6 孔板中，接著進(jìn)行自己需要的實(shí)驗(yàn)處理，處理結(jié)束后開始收蛋白，先用 1×PBS 將細(xì)胞洗兩次，每次吸盡上清。
2、每孔加入 200ul NETN 裂解液，冰上裂解 15min
| High salt NETN buffer | |||
| 母液 | 配制100ML | ||
| 20mM Tris,PH=8.0 | 1M | 2ml | |
| 500mM NACL | 5M | 10ml | |
| 0.5% NP-40 | 20% | 2.5ml | |
| 1mM EDTA | 0.5M | 200ul | |
| H2O | 85.3ML | ||
| 臨用前加蛋白酶抑制劑 | |||
3、用細(xì)胞刮刮細(xì)胞，將細(xì)胞收集于 1.5mlEP 管中，1500g,4℃，離心10min
4、離心結(jié)束后可以在管底看到一小團(tuán)接近透明的沉淀，小心吸盡上清，用 1ML NETN buffer 洗沉淀一次或兩次，1500g,4℃，離心 10min
5、吸盡上清，小心吸，沉淀容易被吸走，加入 0.2M HCL 100ul （濃鹽酸的濃度為 12M）冰水裂解 30min,(30min 后沉淀變成一個(gè)白色的小團(tuán)塊)
6、12000RPM，4℃，15min 離心，此時(shí)組蛋白已經(jīng)溶解在上清中，將上清轉(zhuǎn)移到新的 EP 管中，加入 20ul 的 1M Tris ph=8.0 中和酸性（5 倍體積的 HCL 加 1 倍體積的 1M Tris PH=8.0, 如 100ul 的上清中，可加入 20ul 的 1M Tris。
若中和不充分，則在下一步加入 SDS 的時(shí)候溶液會(huì)呈現(xiàn)黃色，可適量補(bǔ)加 1M Tris PH=8.0，只到溶液恢復(fù)藍(lán)色）。
7、可用考馬斯法測(cè)蛋白濃度
8、用 SDS 煮蛋白，100℃，10min.。接下來可進(jìn)行 Western blot 實(shí)驗(yàn)。
9、跑膠時(shí)，上樣量為 5ug 時(shí)比較適宜�？梢愿鶕�(jù)自己的具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。
然后你就可以有這樣的美美的結(jié)果啦！
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
