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多克隆抗體制備流程
點擊次數(shù)：437 發(fā)布時間：2019/4/8 10:45:04
抗原刺激機體，產(chǎn)生免疫學(xué)反應(yīng)，由機體的漿細胞合成并分泌的與抗原有特異性結(jié)合能力的一組免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結(jié)合能力的免疫球蛋白就是抗體。一般而言，抗體按靶位點不同主要分為單克隆抗體和多克隆抗體 ，由多個B淋巴細胞克隆產(chǎn)生的，受到多種抗原決定簇刺激并可以與多種抗原表位結(jié)合的抗體就是多克隆抗體 ， 本篇主要講述兔源性多克隆抗體制備的相關(guān)流程。
抗原有兩個基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物質(zhì)不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必須經(jīng)過經(jīng)過一定的改造（偶聯(lián)蛋白載體BSA，OVA或者HSA等大分子物質(zhì)）方能成為完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），結(jié)構(gòu)越復(fù)雜引起免疫反應(yīng)的能力也就越強。
抗體就是能與特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白，抗體一般分為多克隆抗體和單克隆抗體，多克隆抗體能與抗原的多個表位結(jié)合。本篇主要講述兔來源的多克隆抗體的生產(chǎn)步驟
多抗一般制備流程：完全抗原的準備→兔子的免疫→效價檢測和終放→抗體親和純化→抗體的濃縮和保存。
具體實驗步驟如下：
1.兔子的準備
挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只（約2Kg），使其適應(yīng)新的生活環(huán)境，至少穩(wěn)定幾天再進行首次取血.
預(yù)采血（作陰性參照用）
1.1 將兔子小心的放入固定的架中,使兔子平靜；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨脹；
1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清)；
1.5小心抽出針頭,適當(dāng)按壓傷口以免流血,然后用酒精棉球消毒傷口；
1.6將收集的血液置于37`C滅活30min,*后置于4`C過夜使其凝結(jié)釋放血清；
1.7將凝結(jié)好的血液在10000r／min離心10min； h.收集上清，即為血清。
2. 兔子的免疫
2.1 注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對兔子有害的化學(xué)試劑.每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合,也可適當(dāng)減少以獲得更好的結(jié)果，后續(xù)免疫每次為100ug即可。
2.2 將1ml的佛氏完全佐劑與準備好的1ml抗原充分混勻,呈乳白色；
2.3 小心從籠中取出兔子，每只兔子免疫4個部位(背部和大腿根部均可),每個部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數(shù)秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期為20天,免疫完后7-10天取血(包括中途測試取血和*終放血),總共免疫4-5次。
3.效價檢測
3.1 2個參照:陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為以前陽性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃過夜，也可以37℃孵育2小時。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封閉液，4℃過夜或者37℃孵育2小時。
3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時間, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，孔加入陰性參照液100ul，第二孔加入陽性參照液100ul，第三孔加入1:500的待測抗血清，后續(xù)各孔在此基礎(chǔ)上倍比稀釋，于37℃孵育1 小時。
3.6倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG（1：2000稀釋），于37℃孵育45分鐘。
3.7倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 單組份TMB ）37℃孵育5—20分鐘(根據(jù)顏色深淺來決定顯色的時間)。
3.8每孔加入50ul的終止液（2N H2SO4），在酶標(biāo)儀上讀取波長450nm處的吸光值。
抗體效價檢測達到100萬以上后可以對兔子進行終放血�？贵w的純化
4.抗體的親和－－-親和柱的制備
4.1 稱取1mg CNBr-Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol／L的鹽酸中，4`C過夜使其充分溶漲，可獲得3ml溶漲膠。
4.2 將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約20ml 2mmol／L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
4.3 用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次，因為活化基團在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟在幾分鐘內(nèi)完成。
4.4 將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中
4.5 室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜，如需測定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測。用20ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室溫下孵育2小時或4`C過夜。
4.7 用磷酸鹽緩沖液洗滌介質(zhì)3次以上，每次15ml以上 h.
4.8抗原固相化完成，可用于純化。
4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的純化和保存
5.1抗血清用PBS等體積稀釋，5000-10000r／min離心15分鐘，取上清.
5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。
5.3將稀釋好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜
5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱，以洗去結(jié)合在柱子上的雜蛋白
5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體
5.7用10倍體積PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脫的抗體后，經(jīng)蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體OD值，所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度，添加40-50%甘油置于-20`C可長期保存。
抗原有兩個基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物質(zhì)不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必須經(jīng)過經(jīng)過一定的改造（偶聯(lián)蛋白載體BSA，OVA或者HSA等大分子物質(zhì)）方能成為完全。一般而言完全抗原分子量越大（大于10KDa），結(jié)構(gòu)越復(fù)雜引起免疫反應(yīng)的能力也就越強。
抗體就是能與特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白，抗體一般分為多克隆抗體和單克隆抗體，多克隆抗體能與抗原的多個表位結(jié)合。本篇主要講述兔來源的多克隆抗體的生產(chǎn)步驟
多抗一般制備流程：完全抗原的準備→兔子的免疫→效價檢測和終放→抗體親和純化→抗體的濃縮和保存。
具體實驗步驟如下：
1.兔子的準備
挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只（約2Kg），使其適應(yīng)新的生活環(huán)境，至少穩(wěn)定幾天再進行首次取血.
預(yù)采血（作陰性參照用）
1.1 將兔子小心的放入固定的架中,使兔子平靜；
1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃)；
1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位,使血管膨脹；
1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清)；
1.5小心抽出針頭,適當(dāng)按壓傷口以免流血,然后用酒精棉球消毒傷口；
1.6將收集的血液置于37`C滅活30min,*后置于4`C過夜使其凝結(jié)釋放血清；
1.7將凝結(jié)好的血液在10000r／min離心10min； h.收集上清，即為血清。
2. 兔子的免疫
2.1 注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對兔子有害的化學(xué)試劑.每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合,也可適當(dāng)減少以獲得更好的結(jié)果，后續(xù)免疫每次為100ug即可。
2.2 將1ml的佛氏完全佐劑與準備好的1ml抗原充分混勻,呈乳白色；
2.3 小心從籠中取出兔子，每只兔子免疫4個部位(背部和大腿根部均可),每個部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數(shù)秒以防止抗原外流。
2.4 免疫周期為20天,免疫完后7-10天取血(包括中途測試取血和*終放血),總共免疫4-5次。
3.效價檢測
3.1 2個參照:陰性參照為預(yù)取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為以前陽性血清
3.2 于96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，于4℃過夜，也可以37℃孵育2小時。
3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封閉液，4℃過夜或者37℃孵育2小時。
3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時間, 37℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
3.5取包被好的96孔板，孔加入陰性參照液100ul，第二孔加入陽性參照液100ul，第三孔加入1:500的待測抗血清，后續(xù)各孔在此基礎(chǔ)上倍比稀釋，于37℃孵育1 小時。
3.6倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的HRP標(biāo)記的小鼠抗兔IgG（1：2000稀釋），于37℃孵育45分鐘。
3.7倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍干。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 單組份TMB ）37℃孵育5—20分鐘(根據(jù)顏色深淺來決定顯色的時間)。
3.8每孔加入50ul的終止液（2N H2SO4），在酶標(biāo)儀上讀取波長450nm處的吸光值。
抗體效價檢測達到100萬以上后可以對兔子進行終放血�？贵w的純化
4.抗體的親和－－-親和柱的制備
4.1 稱取1mg CNBr-Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol／L的鹽酸中，4`C過夜使其充分溶漲，可獲得3ml溶漲膠。
4.2 將凝膠轉(zhuǎn)移入純化柱中，用約20ml 2mmol／L的鹽酸洗介質(zhì)3次。
4.3 用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次，因為活化基團在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解，所以此步驟在幾分鐘內(nèi)完成。
4.4 將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中
4.5 室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜，如需測定結(jié)合效率此步驟結(jié)束后取少量溶液待測。用20ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一次。
4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室溫下孵育2小時或4`C過夜。
4.7 用磷酸鹽緩沖液洗滌介質(zhì)3次以上，每次15ml以上 h.
4.8抗原固相化完成，可用于純化。
4.9 若不立即使用或者使用后，用20%的乙醇封存。
5.抗血清的純化和保存
5.1抗血清用PBS等體積稀釋，5000-10000r／min離心15分鐘，取上清.
5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。
5.3將稀釋好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。
5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜
5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱，以洗去結(jié)合在柱子上的雜蛋白
5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體
5.7用10倍體積PBS平衡柱子
5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。
在得到洗脫的抗體后，經(jīng)蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體OD值，所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度，添加40-50%甘油置于-20`C可長期保存。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
