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感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
目的
掌握感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化的基本方法。
原理
受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法如電擊法, 化學(xué)試劑法（CaCl2 ,RbCl，KCl)等的處理后,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞。
試劑與器材
一、試劑
1、0.1mol/L CaCl2取20ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。
2、LB液體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）
3、LB固體培養(yǎng)基（見實(shí)驗(yàn)一）
4、氨芐青霉素（100mg/mL）
二、器材
1、 冷凍離心機(jī)
2、 平衡天平
3、 無菌操作臺(tái)
4、 微量移液器
操作步驟
一.感受態(tài)細(xì)胞的制備(0.1MCaCl2方法)
1、從LB固體平板挑單克隆于5ml LB液體培養(yǎng)基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可過夜培養(yǎng)。
2、將活化菌體按1`～5％接種到LB中，擴(kuò)大培養(yǎng)37℃×200rpm×2h，至OD600約為0.4。
3、取培養(yǎng)好的菌液1.5 ml于一離心管中，4℃離心8 000rpm×1 min。
4、棄上清，加500 ul 0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)洗菌體，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。
5、徹底除去殘液, 加200 ul 0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體。
6、冰浴靜置 30 min ，4℃冷凍離心8000rpm×1 min。
7、棄上清，加100 ul 0.1M CaCl2 (滅菌預(yù)冷)，懸浮菌體，即為制備好的感受態(tài)細(xì)胞。
附注：
①、整個(gè)過程注意無菌操作和保持低溫。
②、培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長期是制備感受態(tài)細(xì)胞的關(guān)鍵。
③、如果要求高轉(zhuǎn)化效率，不建議使用簡單深凍保存的感受態(tài)細(xì)胞。
④、LB液體培養(yǎng)基建議用不加抗生素和加抗生素的兩種培養(yǎng)基，檢查菌體是否污染。
⑤、D600值指細(xì)胞密度，用于判斷培養(yǎng)物是否處于對(duì)數(shù)生長期。OD600值在0.4 - 0.5時(shí)，此時(shí)培養(yǎng)物處于對(duì)數(shù)生長期，細(xì)胞數(shù)在20min內(nèi)加倍。
二、質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化
1、將連接產(chǎn)物加入100 ul制備好的感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min。
2、42℃熱激90S。
3、迅速冰浴3min。
4、加入300 ul LB液體培養(yǎng)基，37℃輕搖培養(yǎng)45min。
5、加入30 ul X-gal和6 ulIPTG,混勻。
6、取100 ul涂布在含有50 ug/ml氨芐的LB固體培養(yǎng)基中。
7、37℃倒置，避光培養(yǎng)16-20 h。
8、藍(lán)白斑篩選，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
