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大鼠ELISA試劑盒選對，用對，才能事半功倍!
大鼠ELISA試劑盒試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠白細(xì)胞介素1β（IL-1β）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。大鼠ELISA試劑盒選對，用對，才能事半功倍!
一、如何選購
查找待測樣本的蛋白濃度：
可以通過NCBI的文獻(xiàn)，uniprot，pax-dab上給出的蛋白表達(dá)量參考值來比較ELISA試劑盒中給出的樣本值與報(bào)道值是否一致；試劑盒的應(yīng)用種屬、檢測樣本的種類：除試劑盒特別說明外，一般不同種屬不能通用。常見待測樣本種類有：血清和血漿（不同抗凝劑），細(xì)胞上清，和細(xì)胞裂解液，試劑盒中不同樣本的稀釋液不混用；
試劑盒的檢測范圍：
也就是標(biāo)曲范圍，特別要注意待測樣本濃度是否落在標(biāo)曲范圍內(nèi)，對于濃度很高的樣本，可以行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索到比較好的稀釋倍數(shù)后再大量測定樣本。
試劑盒中的稀釋線性及回收率：
a.稀釋線性一般指樣本稀釋線性，是將樣本梯度稀釋下來，看各稀釋梯度濃度是否成線性；參考樣本稀釋線性可以選擇樣本的zui佳稀釋倍數(shù)；
b.稀釋線性也有做加標(biāo)稀釋線性的情況，加標(biāo)稀釋線性是將標(biāo)準(zhǔn)品加入樣本中測定加入的標(biāo)準(zhǔn)品濃度測定是否準(zhǔn)確；同樣也是確定待測樣本稀釋倍數(shù)的參考指標(biāo)。一般線性和回收率的范圍在80%-120%比較合適；
試劑盒的其它指標(biāo)：
a.靈敏度：試劑盒能夠檢測到的樣本zui低濃度的能力，如果待檢指標(biāo)含量很低，需要選擇高靈敏度的ELISA試劑盒；
b.板間和板內(nèi)的變異系數(shù)（CV%）:反映板內(nèi)和不同板之間是否均勻，CV%一般小于10% 比較好。
試劑盒的有效期：
試劑盒的有效期一般是半年至一年，樣本準(zhǔn)備時(shí)間需要考慮到試劑盒的有效期。
二、ELISA如何使用
樣本的準(zhǔn)備：
盡量使用新鮮樣本，不使用有溶血，被細(xì)菌污染、標(biāo)本保存時(shí)間過長和標(biāo)本凝固不全的樣本。ELISA檢測宜采集新鮮標(biāo)本，如不能立即測定，5天之內(nèi)應(yīng)4℃保存，對于1周后檢測的樣本應(yīng)低溫凍存；做好分裝，長時(shí)間凍存的樣本避免反復(fù)凍融。
待測樣本加樣：
待檢樣本過多時(shí)，建議分批操作；需要稀釋的樣本提前做好稀釋，注意選對合適稀釋液；控制好加樣時(shí)間，避免加樣費(fèi)時(shí)過長造成誤差；注意加樣角度，垂直加入孔底，不要接觸孔壁, 做到一份樣本一個(gè)移液頭，防止交叉污染。
溫育和洗板：
溫育時(shí)間和溫度一般根據(jù)試劑盒的說明書進(jìn)行選擇。溫育時(shí)可以采用水浴或者濕盒孵育,避免“邊緣效應(yīng)”。
①手工洗板時(shí)，拍板時(shí)要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離；
②洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢。
顯色：
市售大鼠ELISA試劑盒中，一般是以四甲基聯(lián)苯胺(TMB)為底物的顯色液，反應(yīng)條件為37℃或室溫反應(yīng)15～30 min。顯色反應(yīng)需要避光。
讀數(shù)和數(shù)據(jù)分析：
終止后讀取結(jié)果盡量在15min內(nèi)完成，讀取OD值時(shí)酶標(biāo)儀需先預(yù)熱15～30 min再進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析一般用四參數(shù)和直線擬合法，選擇哪種擬合方式，可以依據(jù)標(biāo)曲的相關(guān)系數(shù)（R2）來確定，R2一般需要大于0.99。
原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司
