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詳細(xì)講解:葉綠素的定量測定實(shí)驗(yàn)

點(diǎn)擊次數(shù)：270 發(fā)布時(shí)間：2018/8/24 15:10:32
實(shí)驗(yàn)方法原理:

根據(jù)葉綠素對可見光的吸收光譜，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定其光密度，而后用公式計(jì)算出葉綠素含量，此法精確度高，且能在未經(jīng)分離的情況下分別測出葉綠素a、b的含量。

根據(jù)朗伯－比爾定律，某有色溶液的光密度D與其濃度C及液層厚度L成正比，即：

D＝kCL

式中k為比例常數(shù)，當(dāng)溶液濃度以重量百分濃度為單位，液層厚度為 1 厘米時(shí)，k稱為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。

如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此溶液在某一波長下的總光密度等于各組分在相應(yīng)波長下光密度的總和，這就是光密度的加和性。

葉綠素a、b在紅光區(qū)的吸收峰分別位于663 nm 和 645 nm，在波長663 nm 下，葉綠素a、b的80％丙酮溶液的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27，在波長645nm下分別為16.75和45.6，可據(jù)此列出下列關(guān)系式：

式中的D663和D645為葉綠素溶液在波長663nm和645nm時(shí)的消光度，Ca和Cb分別為葉綠素a和b的濃度，以毫克/升為單位。

將Ca與Cb相加，即得葉綠素總量CT。

另外，由于葉綠素a、b在652nm處有相同的比吸收系數(shù)（均為34.5），也可在此波長下測定一次消光度（D652）而求出葉綠素a、b的總量：

 
實(shí)驗(yàn)儀器耗材: 新鮮葉片    丙酮    研缽    漏斗   天平    剪刀    燒杯    濾紙     量筒    分光光度計(jì)

實(shí)驗(yàn)步驟:
稱取新鮮葉片0.5克，剪碎置研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂，并加入2-3 ml  80％丙酮，研成勻漿，再加入10 ml  80％丙酮，繼續(xù)研磨充分，用一層加丙酮濕潤過的濾紙過濾，再用少量丙酮將濾紙和研缽上的色素沖洗干凈，定容至25 ml 容量瓶中，搖勻。

吸取葉綠素丙酮提取液2 ml ，加80%丙酮2 ml 稀釋后，倒入1 cm 比色杯中，用分光光度計(jì)分別在波長645nm、663nm和652nm下測定光密度，以80％丙酮為空白對照。

按公式（3）、（4）、（6）分別計(jì)算葉綠素a、b濃度及總濃度（毫克/升）

按下式計(jì)算葉綠素在葉片中的含量：

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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