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聯(lián)系人：王宇豪
技術文章
蛋白質定量實驗:胺衍生法
實驗步驟
1.于分析前至少 30 min 將 15uL 2-巰基乙醇加人到 5 mL OPA 儲存液中, 這一試劑可穩(wěn)定維持一天。所有熒光樣品和相關反應在所有時間內都需要避光。
2.蛋白質標準品 (0.2~10 ug/mL) 和未知濃度的待測樣品在分析前需要調節(jié) pH 至 8.0?10.5。將 10 檢測樣品與 1 〇〇^xLOPA 儲存液 (含 2-巰基乙醇) 混合，于室溫下孵育 15 min。
3.加入 3 mL 0.5mol/L 的 NaOH, 混勻。
4.在激發(fā)光為 340nm, 發(fā)射光為 440~455nm 處，于熒光比色皿內對熒光進行讀數(shù)。
5.在檢測的動態(tài)范圍內蛋白質濃度和熒光之間的聯(lián)系應該是線性的，可以用來估計未知樣品的濃度。
注釋
相比基于吸光度的蛋白質定量分析方法，這 3 種染料都提供了更好的靈敏度和動態(tài)范圍。由于染料在水溶液中的水溶性和穩(wěn)定性更佳，所以 OPA 檢測法普遍優(yōu)于熒光胺檢測法。
使用胺衍生試劑對蛋白質進行定量具有一定的局限性，因為該檢測方法顯示出很大的蛋白質與蛋白質間的變異性，其原因是蛋白質中賴氨酸殘基的數(shù)量不同，同時它需要一個「匹配」的標準品。該檢測方法易被緩沖液中含有的甘氨酸、胺、銨離子和許多生物緩沖液中常見的硫醇所干擾，因而限制了它的應用（表 8.1)。檢測的重復性取決于反應的 pH、蛋白質樣品是否含有殘余的酸性物質等。例如，來自于沉淀操作的樣品，可減少胺的衍生率 (Youetal.，1997)。
一種非共價的胺活性染料—Epicocco，也可用于溶液中總蛋白質量的檢測 (Sigma)，這一方法的機制已有報道 (BellandKaruso，2003;Coghlanetal.，2005)。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
