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酪氨酸酶抗體的檢測方法
點擊次數(shù)：847 發(fā)布時間：2018/8/2 17:22:55
酪氨酸酶（TYR）是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經(jīng)鞘細胞，是黑色素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。Spritz等人證實TYR是一種銅結(jié)合蛋白，有銅A和銅B位點。離子銅特異性能與人TYR結(jié)合，一個位點的銅結(jié)合可以促進另一個位點的銅結(jié)合。組氨酸在銅B位點協(xié)調(diào)其結(jié)合。TYR的多肽鏈的適當(dāng)折疊對銅結(jié)合及其催化活性是關(guān)鍵性的，TYR突變可中斷銅結(jié)合使其催化活性喪失。眼、皮膚白化病是由于TYR基因突變所致，該病TYR陽性患者色素性皮膚損害發(fā)生率高。超氧化物負(fù)離子（O2-）能穿透黑素細胞（MC）入胞內(nèi)，TYR通過利用O2-保護MC，免受O2-細胞毒作用。在黑素瘤患者黑素瘤細胞（MMC）和MC中抗氧化系統(tǒng)失衡，內(nèi)源性反應(yīng)性氧生成，細胞內(nèi)不能抵御內(nèi)源性超氧化物的攻擊.白癜風(fēng)患者血清中TYR抗體的生成，提示白癜風(fēng)的發(fā)病與自身免疫有關(guān)。
檢測方法
TYR抗體在白癜風(fēng)患者血清中檢出。Song等1994年用細菌合成人TYR，免疫印跡法檢測TYR抗體。這種方法相對不敏感且不能定量檢測。Baharav等1996年使用蘑菇TYR，ELISA法檢測TYR抗體，此法敏感，但所用蘑菇TYR與人TYR同源性低。而Xie等1996年則用人MC提取物作為TYR的來源，免疫沉淀法等檢測TYR抗體。Kemp等1997年采用放免法（RIA）檢測TYR抗體。近來此法已被用來檢測自身免疫性疾病患者血清中的特異性抗體。這種方法能敏感定量檢測抗體。
特性
1.抗TYR抗體的產(chǎn)生：用人TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細胞，獲得L-TY細胞，免疫同源性C3H鼠，即用5×106L-TY細胞與等量Frend佐劑混合，腹膜內(nèi)注入有6周鼠齡的雌性C3H鼠體內(nèi)，每次間隔2周，第3，4次用5×106細胞裂解物與等量Frend佐劑混合免疫動物。第4次注射后3天，抽血，分離血清，同時用未轉(zhuǎn)染L細胞去除非特異反應(yīng)性成分，結(jié)果用人TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細胞免疫的8只C3H鼠中，4次免疫后，有4只對TYR cDNA轉(zhuǎn)染L細胞的鼠血清抗體滴度>10-4，C3H鼠免疫前及正常鼠對L-TY細胞無反應(yīng)性。用L-TY細胞免疫動物獲得的血清能沉淀L-TY和有色素MMC細胞裂解物。免疫沉淀法可見分子量為70kD～80kD的寬幅條帶，可能為TYR生物合成中間代謝產(chǎn)物，未轉(zhuǎn)染L細胞，TYR陰性無色素MMC中未見特異性條帶。
2.免疫印跡法檢測TYR抗體：用抗TYR血清10-3稀釋度，在TYR轉(zhuǎn)染L細胞和有色素MMC可見細胞內(nèi)顆粒染色，親代L細胞內(nèi)無胞內(nèi)染色，在L-TY細胞，細胞內(nèi)染色顆粒位于核周和胞質(zhì)內(nèi)。無色素MMC，不表達TYR mRNA，無TYR活性，與TYR抗體無相互作用。有色素MMC和培養(yǎng)MC，高度表達TYR活性，黑素形成多，細胞質(zhì)顆粒深度染色。
3.單克隆抗體.AT99能識別TRP-1糖蛋白，AT99能與人有色素MMC表達的TRP-1和轉(zhuǎn)染L-GP細（用編碼TRP-1全長cDNA轉(zhuǎn)染鼠L細胞獲得）表達的全長人TRP-1cDNA相互作用，且免疫耗竭實驗證實AT99不耗竭能產(chǎn)生分子量為70kD～80kD條帶的抗TYR血清，免疫熒光分析抗TYR抗體與TRP-1，TYR l-GP細胞無相互作用，抗TYR抗體不沉淀來自L-GP細胞的TRP-1。
3.TYR抗體使TYR活性喪失：免疫鼠血清能沉淀鼠MMC，L-TY細胞裂解物，提示免疫鼠血清能滅活有色素MMC及L-TY細胞TYR的活性，加入L-多巴底物后，見黑素形成，提示TYR活性恢復(fù)，免疫沉淀時如用免疫前血清則無黑素形成。
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
