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DNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理

點(diǎn)擊次數(shù)：160 發(fā)布時(shí)間：2018/8/1 16:26:51
堿裂解法原理

    在pH 12.0 ~ 12.6堿性環(huán)境中，細(xì)菌的線性大分子量染色體DNA變性分開(kāi)，而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯f(wàn)ang抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA。

    電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開(kāi)環(huán)、線型三種構(gòu)型

    DNA提取過(guò)程中各種 試劑 的作用及原理

    溶液I—溶菌液：

    溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。

    葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。

    EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）；（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

    2.溶液II－NaOH－SDS液：

    NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。

    但當(dāng)pH＞12或pH＜3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。

    在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6，因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。

    SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：

    （1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解 膜蛋白 而破壞細(xì)胞膜。

    （2）解聚細(xì)胞中的 核蛋白 。

    （3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖 核酸酶 的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。

原創(chuàng)作者：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

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