產(chǎn)品展示
EZ細(xì)胞及動物組織RNA直擴(kuò)RT-PCR試劑盒（一步法）
點擊次數(shù)：5發(fā)布時間：2019/2/26 12:54:01
更新日期：2019/3/27 9:32:56
所 在 地：中國大陸
產(chǎn)品型號：
優(yōu)質(zhì)供應(yīng)
詳細(xì)內(nèi)容
產(chǎn)品名稱：EZ細(xì)胞及動物組織RNA直擴(kuò)RT-PCR試劑盒（一步法）
英文名稱：EZ Cell ａnd Tissue RNA Direct PCR Kit（One Step)
產(chǎn)品規(guī)格：30T/100T
產(chǎn)品報價：1200元/3000元
試劑盒應(yīng)用：細(xì)胞組織或細(xì)胞基因的擴(kuò)增與克隆、RNA病毒基因的擴(kuò)增、RNA病毒PCR診斷、RNA病毒Real-time PCR.。
試劑盒組成：RNA-EZ-1、RNA-EZ-2、RNA-EZ-3、RNA-EZ-4、RT-Enzyme、2*RT-Buffer、ddH2O
保存條件：-20ºC保存。使用前將RNA-EZ-1、RNA-EZ-4在室溫或37ºC充分溶解。RNA-EZ-3、RNA-EZ-4和RT-Enzyme使用時需置于冰上。
使用方法：
細(xì)胞中RNA的擴(kuò)增
（1）將6ul RNA-EZ-1與3ul RNA-EZ-2充分融合。
（2）取20ul細(xì)胞懸液（10^5-10^6cells/ml）,加入上述混合液，混勻。
（3）置于37ºC靜置10分鐘。
（4）加入1ul RNA-EZ-3，混勻。
（5）置于37ºC靜置15分鐘。
（6）置于98ºC加熱5分鐘。
（7）加入60ul的RNA-EZ-4，混勻。
（8）取2ul（7）中處理液進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。
組織塊中RNA的擴(kuò)增
（1）用 H2O 將 RNA-EZ-1 稀釋 5 倍，每 25 μL 的 RNA-EZ-1 稀釋液中加入 3 μL 的 RNA-EZ-2，混合均勻。同時處理多個組織塊時，可以按照以上比例配制預(yù)混液并分裝到每個離心管 26 µL。
（2）切取半顆米粒大小的組織塊（< 3 mm3），完全浸入上述混合液中。
（3）置于 37ºC 靜置 10 分鐘。
（4）加入 1µL RNA-EZ-3，混勻。
（5）置于 37ºC 靜置 15 分鐘。
（6）置于 98ºC 加熱 5 分鐘。
（7）加入 60 μL RNA-EZ-4，混勻。
（8）取 2 μL（7）中處理液進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。
Real-Time PCR
取上述細(xì)胞或組織處理液，加入特異性引物和 TaqMan 探針，可進(jìn)行特異性靶標(biāo) RNA 的絕對定
量檢測。如需進(jìn)行 SYBR Green Real-time PCR，請選擇 EZ021-01/-02（EZ® Cell ａnd Tissue RNA Direct
PCR Kit（One Step)）。
在 RNase free 的離心管中配制 PCR 反應(yīng)體系
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| 25 μL 體系（推薦） | 50 μL 體系 |
| 2×RT-Buffer | 12.5 μL | 25 μL |
| RT-Enzyme | 1 μL | 2 μL |
| Forward Primer (10 μM) | 1 μL | 2 μL |
| Reverse Primer (10 μM) | 1 μL | 2 μL |
| Template DNA | 2 μL | 2 μL |
| RNase free ddH2O | 7.5 μL | 17 μL |
按照以下方法設(shè)定 PCR 反應(yīng)
| 步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
| 反轉(zhuǎn)錄 | 50 ℃ | 30 min |
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| 預(yù)變性 | 94 ℃ | 3 min |
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| 變性 | 94 ℃ | 30s | 30-35 |
| 退火 | 50-72 ℃ | 30s | 30-35 |
| 延伸 | 72 ℃ | 30s-3min（1 kb/min） | 30-35 |
| *終延伸 | 72 ℃ | 10min |
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| 4 ℃ | Hold |
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（1）取樣的細(xì)胞量應(yīng)當(dāng)適中，濃度不宜過高或過低，處理后溶液應(yīng)當(dāng)以透明為宜。
（2） 樣品處理過程中應(yīng)當(dāng)防止交叉污染，推薦設(shè)置陰性對照參與處理過程，以檢測環(huán)境的污染。
（3）用本產(chǎn)品擴(kuò)增的 RNA 不宜太長，1000bp 及以內(nèi)的片段*佳，前期研究中可擴(kuò)增長達(dá) 1800bp的片段，擴(kuò)增片段越長效率越低。擴(kuò)增的成功率也與 RNA 的豐度、二級結(jié)構(gòu)以及引物等有關(guān)。
（4）本產(chǎn)品同樣適用于相應(yīng)的細(xì)胞或組織中 RNA 病毒的 PCR、Real-Time PCR 診斷。
（5）2×RT-Buffer 中加入了染料和相應(yīng)試劑，可直接進(jìn)行電泳，無需另加 Loading buffer。
（6）處理 96 孔板中的細(xì)胞時，可按照 ddH2O:RNA-EZ-1:RNA-EZ-2=20:5:3 的比例配制預(yù)混液，使用多道移液器直接加入 96 孔板經(jīng) DPBS 洗滌的細(xì)胞中，實現(xiàn)高通量操作。
（7）2×RT-Buffer 中的染料不影響 TaqMan 探針的效果。
