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96T人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒促銷
點(diǎn)擊次數(shù)：2發(fā)布時間：2017/8/9 10:50:03
更新日期：2017/8/9 10:50:03
所 在 地：中國大陸
產(chǎn)品型號：
相關(guān)標(biāo)簽：96T人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒促銷
優(yōu)質(zhì)供應(yīng)
詳細(xì)內(nèi)容
96T人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒促銷
1. ELISA試劑盒及待測樣本
2. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
3. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭
4. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
5. 吸水紙
滿足標(biāo)準(zhǔn)
1.樣本要求：液態(tài)類標(biāo)本（細(xì)胞培養(yǎng)上清、組織勻漿、血清、血漿、尿液、胸水、腹水、腦積液等）
2.樣本量：每個樣本收集體積=120µl*檢測指標(biāo)數(shù) 。
3.樣本保存：請盡早檢測，2-8℃保存一天；需更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存。如需周期收集樣本，請將樣本及時分裝標(biāo)號后，置-20℃或-70℃保存。
4.服務(wù)時限和內(nèi)容：收到樣本之日起10個工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，具體包括實(shí)驗(yàn)方法、步驟、所用試劑、儀器、相關(guān)數(shù)據(jù)等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將以電子或書面形式提交給您。
樣本制備及注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后取上清；
2.組織勻漿：切割標(biāo)本后，稱重，按1：9生理鹽水勻漿，5000轉(zhuǎn)/分離心3-5分鐘后取上清；
3.血清：樣本室溫放置2小時或4℃過夜后取上清；
4.血漿：可用EDTA、枸櫞酸鈉或肝素作為抗凝劑（根據(jù)試劑盒要求選擇），樣本加入10%抗凝劑混合10-20分鐘，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后取上清；
5.尿液、胸水、腹水、腦積液等：2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后取上清。
一、高效、靈敏、特異的抗體；
二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性；
三、吸附性能好,空白值低,孔底透明度高的固相載體；
四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標(biāo)本類型；
五、限度的節(jié)省實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi).
96T人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒促銷
人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒性能:
1．準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。
2．靈敏度：檢測濃度小于10 pg/ml。
3．特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4．重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。
我公司提供的試劑盒受到了廣大科研單位的一致肯定和認(rèn)同。
性能特點(diǎn)
ELISA的技術(shù)要點(diǎn)包括三個方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。
ELISA的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。
（一）固相載體
可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，*常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在ELISA測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。
ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，*后放入分光光度計(jì)中比色。小珠一般為直徑0.6cm的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。*常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成8聯(lián)或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的特點(diǎn)是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果�，F(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應(yīng)板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計(jì)算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。
與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。
為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和一個典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別，這種載體就是這一ELISA測定的*合適的固相載體。
除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章第五節(jié)“膜載體的酶免疫測定”中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。
[抗原和抗體]
（一）：在人表皮生長因子(EGF)Elisa試劑盒實(shí)施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強(qiáng)。
ELISA所用抗原有三個來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。
用于ELISA的抗體有多克隆的和單克隆的�？寡宄煞謴�(fù)雜，應(yīng)從中提取IgG才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的IgG可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性IgG，如用酶消化IgG后提取的Fab片段，則效果更好。
（三）免疫吸附劑
固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（*常用的為pH9.6的碳酸緩沖液）中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)完全覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，*后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的ELISA板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。
（四）酶和底物
ELISA中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA中*常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。
HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約18％；分子量為44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在275nm波長處有吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有吸收峰。HRP催化下列反應(yīng)：
上式中DH2為供氫體，H2O2O為受氫體。HRP對受氫體的專一性很高，除H2O2外，僅作用于小分子醇的過氧化物和尿素的過氧化物。后者為固體，作為試劑較H2O2方便。許多化合物可作為HRP的供氧體，在ELISA中常用的供氫體底物為鄰苯二胺（orthopenylenediamine，OPD）、四甲基聯(lián)苯胺（3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS[2，2＇-azino-bis(3-ethyl-benzthiazolinesulfonate-6)]。
OPD為在ELISA中應(yīng)用*多的底物，靈敏度高，比色方便。其缺點(diǎn)是配成應(yīng)用液后穩(wěn)定性差，而且具有致異變性。TMB無此缺點(diǎn)。TMB經(jīng)酶作用后由無色變藍(lán)色，目測對比鮮明；加酸停止酶反應(yīng)后變黃色，可在比色計(jì)中定量；因此應(yīng)用日見增多。ABTS，雖然靈敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。HRP催化OPD的反應(yīng)如下：
HRP的純度用RZ（ReinheitZahl，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm的吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥3.0。應(yīng)注意的是酶變性后，RZ可不變而活力降低，故重用酶制劑時更重要的指標(biāo)為活力。酶活力以單位表示：1min將1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量為1個單位。
在ELISA中另一常用的酶為堿性磷酸酶。從大腸桿菌提取的AP分子量為80kD，酶作用的*適pH為8.0；用小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kD，*適pH為9.6。一般采用對硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作為底物。它可制成片狀試劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一段時間。反應(yīng)式如下：
在ELISA中應(yīng)用AP系統(tǒng)，其敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價格較HRP高，制備酶結(jié)合物時得率較HRP低等原因，國內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。
除HRP和AP以外，在商品ELISA試劑中應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和脲酶等。β-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基傘基-β-D半乳糖苷（4-mehtyumbelliferyl-β-D-galactoside），經(jīng)酶水解后產(chǎn)生熒光物質(zhì)4-甲基傘酮（4-mehtylumbelliferone），可用熒光計(jì)檢測。熒光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可應(yīng)用可產(chǎn)生熒光的傘基磷酸酯作底物。其缺點(diǎn)是需要熒光計(jì)測定，而且如用固相載體直接作為測定容器，此載體不可發(fā)出熒光。脲酶的特點(diǎn)是酶作用后反應(yīng)液發(fā)生pH改變，可使指示劑變色；另外，在人體內(nèi)沒有內(nèi)源酶（酶的化學(xué)發(fā)光底物見第十八章）。
（五）結(jié)合物酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)
合物的方法通常有以下幾種。
1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接AP），也可用二步法（如連接HRP）。舉例如下：
2～5mg純抗體與5mgAP混合于0.1mol/LpH6.8的磷酸緩沖液1ml中，4℃下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入1％戊二醛0.05ml，在室溫下放置2小時。在4℃下對0.05mol/LpH8.0Tris緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體。
辣根過氧化物酶可溶解于50％飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用50％飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶。
戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。
制備HRP抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將HRP與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法10倍左右。
2．過碘酸鹽氧化法本法只用于HRP的交聯(lián)。該酶含18％碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)*有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中*后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用SephadexG-200凝膠過濾的好。
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[*適工作濃度的選擇]
在建立某一ELISA測定中，應(yīng)對包被抗原或抗體的濃度和酶標(biāo)抗原或抗體的濃度予以選擇，以達(dá)到*合適的測定條件和節(jié)省測定費(fèi)用。下面以間接法測抗體和夾心法測抗原為例，介紹*適工作濃度的選擇方法。
（一）間接法測抗體
1．酶標(biāo)抗抗體工作濃度的選擇
（1）用100ng/ml人IgG進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將酶標(biāo)抗人IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。
（3）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度（A），繪制曲線如圖15-10。讀取A值在1.0時的酶標(biāo)抗體稀釋度，作為酶標(biāo)抗體的工作濃度。該酶標(biāo)抗人IgG的工作濃度應(yīng)為1/1600。
2．棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度
（1）用包被液將抗原作一系列稀釋后進(jìn)行包被，洗滌。
（2）將強(qiáng)陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用稀釋液作1:100稀釋，加樣，保溫，洗滌。
（3）加按工作濃度稀釋的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫，洗滌。
（4）加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。
（5）選擇強(qiáng)陽性參考血清的A值為0.8左右、陰性參考血清的A值小于0.1的包被抗的的稀釋度作為工作濃度。表15-1為本例的測定結(jié)果，表中數(shù)字為A值。從表中可見1:200為*舒適的工作濃度。
表15-1 間接ELISA法包被抗原工作濃度的選擇
各類血清 抗原稀釋度
1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
強(qiáng)陽性 1.20 1.04 0.84 0.68 0.42
弱陽性 0.64 0.41 0.30 0.22 0.19
陰性 0.23 0.13 0.08 0.66 0.05
稀釋液 0.09 0.02 0.02 0.02 0.04
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*特別提醒*
1.取樣和存樣所用的凍存管、離心管、吸頭等需高溫滅菌處理；
2.所有存樣管口需以封口膜封好；3.所有樣品管壁需要用防水記號筆清晰標(biāo)明編號（便于區(qū)分即可）；
4.所有樣品避免反復(fù)凍融5.如有特別要求，請與服務(wù)該區(qū)域的銷售經(jīng)理講明。
