艾美捷蛋白質(zhì)羰基比色測(cè)定試劑盒利用DNPH反應(yīng)以方便的96孔格式測(cè)量血漿、血清、細(xì)胞裂解物或組織勻漿中的蛋白質(zhì)羰基含量。在360-385nm之間的吸光度下用分光光度法定量所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)水帶的量。然后可以將羰基含量標(biāo)準(zhǔn)化為蛋白質(zhì)濃度。

非自由基ROS、毒物（如香煙煙霧），或與脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的醛發(fā)生二次反應(yīng)。蛋白質(zhì)羰基化在血漿、尿液、支氣管肺泡灌洗液（BALF）或多種疾病狀態(tài)下的組織中升高，包括急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）、阿爾茨海默病、慢性腎衰竭、敗血癥和糖尿病。

已經(jīng)采取了幾種方法來檢測(cè)和定量蛋白質(zhì)制劑中的羰基含量。方便的方法是2，4-二硝基苯肼（DNPH）與蛋白質(zhì)羰基之間的反應(yīng)。

艾美捷蛋白質(zhì)羰基比色測(cè)定試劑盒計(jì)算：

1.計(jì)算每個(gè)樣品和對(duì)照的平均吸光度。

2.從樣品的平均吸光度中減去對(duì)照的平均吸度。這是校正吸光度（CA）。

3.通過插入校正的吸光度轉(zhuǎn)換為下式：

蛋白質(zhì)羰基（nmol/ml）=[（CA）/（*0.011µM-1）]（500µl/200µl）

*DNPH在370nm處的實(shí)際消光系數(shù)為22000 M-1cm-1

（0.022µM-1cm-1）。此值已根據(jù)解決方案的路徑長(zhǎng)度進(jìn)行了調(diào)整顆粒中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（可選）蛋白質(zhì)在洗滌步驟中丟失；因此，蛋白質(zhì)水平取決于洗滌后的終顆粒。

1.將100μl樣品對(duì)照（C#）從其中一個(gè)孔轉(zhuǎn)移到1 ml石英試管中，并加入900μl鹽酸胍。這是1:10的稀釋。如果需要進(jìn)一步稀釋，用鹽酸胍稀釋。

2.在濃度范圍為0.25-2.0 mg/dl的氯化胍中制備BSA標(biāo)準(zhǔn)品（不包括）。

3.使用分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)稀釋樣品對(duì)照（C#）和每個(gè)BSA標(biāo)準(zhǔn)品在280nm處的吸光度。

4.繪制BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度與濃度的關(guān)系圖，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用其吸光度和BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算每個(gè)樣品對(duì)照的濃度——蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=[（A280-y截距）/斜率]x*2.5 x 10（稀釋系數(shù)）

*2.5是將結(jié)果調(diào)整回原始樣品體積的校正因子。

羰基含量（nmol/mg）=（羰基nmol/ml）/（蛋白質(zhì)mg/ml）

或者，可以使用Cayman’s Protein Determination（BCA）（項(xiàng)目號(hào)701780）、Protein Determination Kit（項(xiàng)目編號(hào)704002）或類似的測(cè)定來測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。

艾美捷蛋白質(zhì)羰基比色測(cè)定試劑盒樣品制備：

當(dāng)樣品的蛋白質(zhì)濃度在1-10mg/ml范圍內(nèi)時(shí)，該測(cè)定效果佳。建議使用Cayman的蛋白質(zhì)測(cè)定（BCA）試劑盒（項(xiàng)目號(hào)701780）、蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒（產(chǎn)品號(hào)704002）或類似的蛋白質(zhì)測(cè)定測(cè)定法來測(cè)量總蛋白質(zhì)濃度。

血漿

通常，人血漿的蛋白質(zhì)羰基含量為0.5-4.0 nmol/mg。5

1.使用抗凝劑如肝素、EDTA或檸檬酸鹽采集血液。

2.在4°C下以700-1000 x g離心血液10分鐘。用移液管移走頂部的黃色等離子體層，不要干擾白色血沉棕黃層。將血漿保存在冰上，直到測(cè)定或在-80°C下冷凍。血漿樣品將穩(wěn)定至少一個(gè)月。

血清

通常，人血清的蛋白質(zhì)羰基含量為0.1-1.0 nmol/mg。6

1.不使用抗凝血?jiǎng)┎杉�。讓血液在室溫下凝結(jié)30分鐘。

2.在4°C下以2000 x g離心血液15分鐘。用移液管移走頂部黃色血清層，不要干擾白色血沉棕黃層。將血清保存在冰上。如果當(dāng)天不進(jìn)行分析，則在-80°C下冷凍。樣品將穩(wěn)定至少一個(gè)月。

相關(guān)文獻(xiàn)：

1.Dalle-Donne, I., Giustarini, D., Colombo, R., et al. Protein carbonylation in human diseases. Trends Mol. Med. 9(4), 169-176 (2003).

2.Stadtman, E.R. ａnd Oliver, C.N. Metal-catalyzed oxidation of proteins. Physiological consequences. J. Biol. Chem. 266(40), 2005-2008 (1991).

3.Reznick, A.Z., Cross, C.E., Hu, M.-L., et al. Modification of plasma proteins by cigarette smoke as measured by protein carbonyl formation. Biochem. J. 286, 607-611 (1992).

4.Dalle-Donne, I., Rossi, R., Giustarini, D., et al. Protein carbonyl groups as

biomarkers of oxidative stress. Clin. Chim. Acta 329(1-2), 23-38 (2003).

5.Lenz, A-G., Jorens, P.G., Meyer, B., et al. Oxidatively modified proteins in bronchoalveolar lavage fluid of patients with ARDS ａnd patients at-risk for ARDS. Eur. Respir. J. 13(1), 169-174 (1999).

6.Levine, R.L., Williams, J.A., Stadtman, E.R., et al. Carbonyl assays for determination of oxidatively modified proteins. Methods Enzymol. 233, 346-357 (1994).

7.Reznick, A.Z. ａnd Packer, L. Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric

method for carbonyl assay. Methods Enzymol. 233, 357-363 (1994).

來源：https://www.amyjet.com/products/10005020-96.shtml