Principles ａnd Procedures

Amyjet Plant chromatin immunoprecipitation (ChIP) Kit # P-2014-24 includes all reagents required for successful chromatin immunoprecipitation from plant cells. Specifically, the kit includes ChIP grade dimethylhistone H3-K9 antibodies ａnd negative control normal mouse IgG. The chromatin in the cells was extracted, cut ａnd added into the micropores fixed with antibodies. DNA is released from the protein DNA complex captured by antibodies, ａnd is reversed ａnd purified through a specially designed F-Spin column. The washed DNA can be used for various downstream applications.

蛋白質(zhì)與DNA的相互作用對細(xì)胞功能起著關(guān)鍵作用，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄、染色體分離、DNA復(fù)制和重組以及表觀遺傳沉默。在植物中，DNA結(jié)合蛋白和同源啟動子序列之間的相互作用是建立影響體內(nèi)平衡、發(fā)育和適應(yīng)的基因空間和時間表達(dá)模式的主要決定因素。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）為鑒定特定調(diào)節(jié)蛋白與其靶基因之間的直接全基因組關(guān)聯(lián)提供了一種有利的工具。與EMASA、DNA微陣列和報(bào)告基因分析等在體外分析蛋白質(zhì)和DNA之間直接相互作用的其他方法不同，ChIP可以檢測特定蛋白質(zhì)與活細(xì)胞中基因的特定序列結(jié)合。

原則與程序

艾美捷植物染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試劑盒#P-2014-24包括從植物細(xì)胞成功進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀所需的所有試劑。特別地，該試劑盒包括ChIP二甲基組蛋白H3-K9抗體和陰性對照正常小鼠IgG。將細(xì)胞中的染色質(zhì)提取、剪切并加入用抗體固定的微孔中。DNA從抗體捕獲的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物中釋放出來，通過門設(shè)計(jì)的F-Spin柱進(jìn)行逆轉(zhuǎn)和純化。洗脫的DNA可用于各種下游應(yīng)用。

植物染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試劑盒#P-2014-24：

英文名稱：EpiQuik Plant Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Kit

中文名稱：植物染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）試劑盒

cat#：P-2014-24/P-2014-48

規(guī)格：24Reactions/48Reactions

植物染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)試劑盒#P-2014-24組織裂解和DNA剪切：

1.通過加入1.25ml的2M甘氨酸溶液（終濃度0.125M）來驟冷交聯(lián)繼續(xù)真空滲透另外5分鐘。

2.去除甲醛，用20毫升去離子水沖洗紙巾兩次。在沖洗，盡可能多地去除水分（在這個階段，交聯(lián)組織可以冷凍在液氮中，儲存在–80°C，或直接用于染色質(zhì)提�。�。

3.用蒸餾水以1:5的比例稀釋CP3C（1X CP3C）。每10 ml 1X中加入3.5µl BME CP3C中。將紙巾在液氮中研磨成細(xì)粉末。將粉末加入20毫升冷1X中 CP3C在一個50毫升的錐形管中，然后渦旋，放在冰上。

4.通過兩層Miracloth將溶液過濾到50毫升的試管中，并離心過濾后的溶液在4000轉(zhuǎn)/分（1900X克）下進(jìn)行20分鐘。

5.在每1ml CP3D中加入1µl BME。取出上清液，將沉淀重新懸浮在1ml包含BME的CP3D。將重新懸浮的顆粒轉(zhuǎn)移到1.5毫升的小瓶中，并在12000下離心在4°C下以每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)旋轉(zhuǎn)10分鐘，以沉淀細(xì)胞核（在此階段應(yīng)看到白色沉淀）。

6.在每1ml CP3E中加入1µl BME。取出上清液，將沉淀重新懸浮在300µl含有BME的CP3E。

7.將300µl含有BME的CP3E加入一個新的1.5 ml小瓶中。將重新懸浮的顆粒分層步驟6在這個300µl的墊子上，在4°C下以14000 rpm離心45分鐘。

8.取出上清液，將染色質(zhì)沉淀重新懸浮在500µl含有蛋白酶的CP3F中抑制劑雞尾酒（PIC）（例如：每1ml CP3F中加入10µl PIC）。通過超聲處理剪切DNA。例如，在冰上超聲處理染色質(zhì)溶液五次，每次15，占空比為40%。將樣品放在冰上1分鐘超聲處理。（交聯(lián)DNA剪切的條件可以基于細(xì)胞和聲波儀設(shè)備。如果需要，去除5µl超聲處理的細(xì)胞裂解物以獲得瓊脂糖凝膠分析剪切DNA的長度應(yīng)在200-1000bp之間。）

9. 通過在4°C下以14000rpm離心10分鐘來沉淀顆粒細(xì)胞碎片。

來源：https://www.amyjet.com/products/P-2014-24.shtml