艾美捷丙二醛(MDA)elisa檢測(cè)試劑盒#EKF60157樣品采集和儲(chǔ)存（通用）：

血清：將全血樣品在室溫下放置2小時(shí)，或在2-8°C下放置過夜，以約1000×g離心20分鐘，收集上清液并立即進(jìn)行測(cè)定。采血管應(yīng)該是一次性的、無熱原的、無內(nèi)毒素的。

血漿：使用EDTA-Na2或肝素作為抗凝劑收集血漿。在收集樣品后30分鐘內(nèi)，在2-8°C下，以1000×g離心15分鐘。收集上清液并立即進(jìn)行測(cè)定。避免溶血、高膽固醇樣品。

組織勻漿：由于溶血性血液與測(cè)定結(jié)果有關(guān)，有必要通過用預(yù)冷卻的PBS緩沖液（0.01M，pH=7.4）清洗組織來去除殘留的血液。稱重后將組織切碎，并在PBS中勻漿（體積取決于組織的重量。正常情況下，9mL PBS適用于1克組織片。建議將一些蛋白酶抑制劑添加到PBS中），并在冰上使用玻璃勻漿器。為了進(jìn)一步破壞細(xì)胞，你可以用超聲波細(xì)胞破壞器對(duì)懸浮液進(jìn)行超聲處理，或者對(duì)其進(jìn)行凍融循環(huán)。然后將勻漿以5000×g離心5分鐘以獲得上清液�？偟鞍诐舛韧ㄟ^BCA試劑盒測(cè)定，每個(gè)孔樣品的總蛋白濃度不應(yīng)超過0.3mg。

粘附和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：使用三個(gè)T25燒瓶或一個(gè)T75燒瓶進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量（1x107）；

1.懸浮細(xì)胞：以2500rpm在2-8℃下離心5分鐘；收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液；

2.粘附細(xì)胞：直接收集上清液；在2-8℃下以2500rpm離心5分鐘；收集澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以立即檢測(cè)或在-80℃下單獨(dú)儲(chǔ)存

細(xì)胞裂解物的制備：兩種類型的細(xì)胞裂解物如下所述。

1.懸浮細(xì)胞裂解物：以2500rpm在2-8℃下離心5分鐘；然后將預(yù)冷卻的PBS加入收集的細(xì)胞中，輕輕混合。通過重復(fù)離心重新收集細(xì)胞。加入0.5-1ml RIPA裂解緩沖液（由于干擾抗原抗體反應(yīng)，不建議使用NP-40裂解緩沖液或Triton X-100表面活性劑）。添加合適的蛋白酶抑制劑（如PMSF，工作濃度：1mmol/L）。在冰上溶解細(xì)胞30分鐘-1小時(shí)。在裂解過程中，使用移液器吸移或間歇搖動(dòng)離心管以完全裂解蛋白質(zhì)�；蛘�，通過超聲波細(xì)胞分裂器使細(xì)胞破碎（300W，3~5/次，30間隔，4-5次）或超聲波發(fā)生器（14μm，30）。裂解液或超聲波破碎結(jié)束時(shí)，以10000rpm在2-8℃下離心10分鐘。然后，將上清液加入EP管中，并在-80℃下儲(chǔ)存。

2.粘附細(xì)胞裂解物：吸收上清液，加入預(yù)冷PBS一次。然后，加入0.5-1ml RIPA裂解緩沖液（由于干擾抗原抗體反應(yīng)，不建議使用NP-40裂解緩沖液或Triton X-100表面活性劑）。添加合適的蛋白酶抑制劑（如PMSF，工作濃度：1mmol/L）。用細(xì)胞刮刀輕輕刮去附著的細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液加入離心管中。在冰上溶解細(xì)胞30分鐘-1小時(shí)。在裂解液處理過程中，使用尖端移液或間歇性搖動(dòng)離心管以完全裂解蛋白質(zhì)�；蛘�，通過超聲波發(fā)生器（14μm，持續(xù)30s）或超聲波細(xì)胞破壞器（300W，3~5s/次，間隔30s，4-5次）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破碎。裂解物/超聲波破碎結(jié)束時(shí)，在2-8℃下以10000rpm離心10分鐘。然后，將上清液加入EP管中，并在-80℃下儲(chǔ)存。

其他生物流體：在2-8°C下，以1000×g離心樣品20分鐘。收集上清液并立即進(jìn)行測(cè)定。

丙二醛(MDA)elisa檢測(cè)試劑盒試劑制備和儲(chǔ)存：

使用，將所有試劑和樣品置于室溫下20分鐘。

1、洗滌緩沖液：

如果濃縮液中形成晶體，可以用40°C水浴加熱（加熱溫度不應(yīng)超過50°C）并將其輕輕混合，直到晶體完全溶解。溶液在使用應(yīng)冷卻至室溫。

用去離子水或蒸餾水將30ml（對(duì)于48T為15ml）濃縮洗滌緩沖液稀釋至750ml（對(duì)于48T為375ml）洗滌緩沖液

（去離子水或蒸餾水的推薦電阻率為18MΩ）。將未使用的溶液放回2-8°C。

2、標(biāo)準(zhǔn)：

1). 將1ml樣品稀釋緩沖液加入一根標(biāo)準(zhǔn)管（標(biāo)記為零管）中，使管在室溫下保持10分鐘并充分混合。

注：如果標(biāo)準(zhǔn)管濃度高于試劑盒的范圍，請(qǐng)稀釋并標(biāo)記為零管。

2). 用1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和空白分別標(biāo)記7根EP管。向每個(gè)樣品中加入0.3ml樣品稀釋緩沖液

管將0.3ml上述標(biāo)準(zhǔn)溶液（來自零管）加入管，并充分混合。從個(gè)轉(zhuǎn)移0.3ml管至第二管，并將它們充分混合。將0.3ml從第二管轉(zhuǎn)移到第三管，并將其充分混合，以此類推。樣品空白對(duì)照使用稀釋緩沖液。

注意：好在2小時(shí)內(nèi)使用標(biāo)準(zhǔn)解決方案。

3、生物素標(biāo)記抗體工作液的制備：

在實(shí)驗(yàn)1小時(shí)內(nèi)準(zhǔn)備好。

1） 計(jì)算所需的工作溶液總體積：0.05ml/井×井?dāng)?shù)。（允許比總體積。）

2） 用抗體稀釋緩沖液以1:100稀釋生物素檢測(cè)抗體，并將其充分混合。（即將1ul生物素標(biāo)記的抗體加入99ul抗體稀釋緩沖液中。）

4、HRP-鏈親和素偶聯(lián)物（SABC）工作溶液的制備：

在實(shí)驗(yàn)30分鐘內(nèi)準(zhǔn)備好。

1） 計(jì)算所需的工作溶液總體積：0.1ml/孔×孔數(shù)。（允許比總量多0.1-0.2ml體積）

2） 用SABC稀釋緩沖液以1:100稀釋SABC，并將其充分混合。（即在99ul SABC稀釋液中加入1ul SABC緩沖區(qū)。）

來源：https://www.amyjet.com/products/EKF60157.shtml