本試劑盒可用于測定血清、血漿、細胞和組織中的14,15-DHET分離和純化。以下幾頁提供了關于正確隔離和純化的說明。這種競爭性ELISA試劑盒，基于14,15-DHET表位和14,15-DH ET-HRP綴合物之間的競爭對于可從抗14，15-DHET抗體獲得的有限數(shù)量的結(jié)合位點，其被涂布到96孔ELISA板。共軛物濃度在每個孔中保持恒定，而14，15-DHET是可變的，基于樣品或標準物的濃度。因此，14,15的數(shù)量-能夠與每個孔結(jié)合的DHET綴合物與14，15的濃度成反比-標準品或樣品中的DHET。結(jié)合到每個孔的綴合物的量然后由當添加TMB時所獲得的顏色的量。TMB與井中可用的HRP反應。使用加入硫酸，藍色的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為黃色的產(chǎn)物，可以在450納米的平板讀數(shù)器。

14，15-DHET是可溶性環(huán)氧化物水解酶（sEH）介導的EET代謝的代表性代謝產(chǎn)物，由細胞色素P450（CYPs）2C和2J的花生四烯酸環(huán)氧合酶活性產(chǎn)生。這種競爭具有HRP系統(tǒng)的ELISA試劑盒已用于測定生物樣品（組織，血漿和尿液）和細胞培養(yǎng)基。使用艾美捷14,15-DHET Hypertension ELISA#DH1，已發(fā)現(xiàn)強正相關發(fā)現(xiàn)高血壓、腦損傷和中風患者的14,15-DHET水平，轉(zhuǎn)移性腦脊髓炎患者的EET水平癌細胞表型和胰島素抵抗。下一代高血壓藥物的發(fā)現(xiàn)在幾個實驗室進行。96孔板的每個試劑盒適用于頂多24個樣品的一式三份分析。

儲存和穩(wěn)定性：

如果所有組件在使用都儲存在適當?shù)臏囟认�，該套件將獲得較佳效果。項目應在收到此試劑盒后在指定溫度下儲存。所有成分都儲存在-20°C以下，不應過度冷凍和解凍。

注意事項：

▪ 在開始分析之，請仔細閱讀所有說明。

▪ 該試劑盒中的試劑經(jīng)過測試和配制，以達到佳效果。此套件可能不起作用如果更換了任何試劑或修改了任何程序，則正確。

▪ 本試劑盒僅供研究使用，不得用于診斷。

程序性說明：

▪ 移除所有需要的試劑，包括TMB，并使其平衡至室溫在進行測定之。

▪ 有必要將濃縮的緩沖溶液充分混合。每個緩沖液中包含一個攪拌棒解決方案

樣品制備：

根據(jù)14,15-DHET所處的介質(zhì)，有不同的分離和純化方案。下面列出了不同的協(xié)議。為了獲得較好的結(jié)果，遵循基于生物學的適當方案樣品存在：

14,15-DHET在細胞中的測量

1.使用含有終濃度約0.1 mM TPP（三苯基膦，0.03-0.05 mg/mL）的溶液收集并勻漿和/或超聲處理細胞。TPP是一種抗氧化劑，看起來像沉淀在樣品中，因為它不容易溶解。在使用含有TPP的儲存樣品之，旋轉(zhuǎn)樣品以從樣品溶液中分離沉淀的TPP。

2.用乙酸將整個均化的細胞酸化至約3-4的pH。測量使用標準pH紙。

3.用乙酸乙酯萃取。向均質(zhì)細胞中加入等體積的乙酸乙酯渦流非常好。離心后，將上層有機相放入新鮮干凈的試管中。然后添加將另一等體積的乙酸乙酯加入均化細胞中，開始第二次提取。強烈建議進行三次提取

4.從提取物中蒸發(fā)合并的乙酸乙酯，直到所有乙酸乙酯都在氬氣或氮氣下干燥。

5.皂化（如需要）（見下文）

6.向20μL乙醇或N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中加入10μL，以重組上述步驟#4的干燥殘留物。加入0.5 mL 1x樣品稀釋緩沖液（試劑盒中提供）。在ELISA平板上，每孔加載100μL，一式三份。（注意：我們建議測量不同的稀釋度樣本，試圖將結(jié)果擬合到標準曲線。例如，添加3個孔，其中50μL為樣品加50μL 1x樣品稀釋緩沖液，3孔，其余樣品加90μL，10μL1x樣品稀釋緩沖液。）

7.進行14,15-DHET的ELISA（根據(jù)制造商的說明）

皂化作用（從甘油骨架上裂解脂肪酸）：

1.將干燥的脂肪酸（從3X乙酸乙酯提取物中獲得）溶解在2 mL 20%KOH溶液中（制作工作溶液：1 mL 2 M KOH+4 mL甲醇，使KOH的終濃度=0.4 N）。

2.渦旋并在50°C下孵育1小時。

3.向溶液中加入1.5 X H2O，并用20%甲酸將pH調(diào)節(jié)至pH~5。

4.用乙酸乙酯（1份水溶液+1份乙酸乙酯）重新提取溶液并干燥。

14,15-DHET在組織中的測量

1.將1g組織、4mL H2O和0.01mg TPP均勻化。

2.通過向每個勻漿中加入8μL乙酸來酸化勻漿。

3.用等量的乙酸乙酯提取，徹底渦旋，向下旋轉(zhuǎn)，收集有機物階段再重復兩次提取，將所有有機相合并。

4.用氬氣或氮氣干燥有機相。

5.皂化（如果需要）（參見細胞中的14,15-DHET測量）

6.用乙醇或DMF溶解來自上述步驟#4的干燥殘留物。（添加約20μL乙醇或DMF以重新構(gòu)成干燥的殘留物。）

7.用1x樣品稀釋緩沖液進一步稀釋：加入約0.5 mL 1x樣品稀釋劑緩沖并在室溫下以10000rpm離心5分鐘。上清液將用于ELISA。

8.進行14,15-DHET的ELISA（根據(jù)制造商的說明）。

化驗準備：

提供了固體96孔板和TMB溶液，以便隨時使用。其他化驗試劑的制劑為詳細內(nèi)容如下。

洗滌緩沖液：將溶液混合，用小火加熱，直到得到透明無色的溶液。稀釋整個用225毫升去離子水洗滌緩沖濃縮物（25毫升）的含量，得到250毫升的終體積1倍洗滌緩沖液。然后可以在試劑盒的整個使用壽命內(nèi)對其進行冷藏。

HRP綴合物：用12.00 mL的1X HRP緩沖液稀釋1小瓶14,15-DHET-HRP綴合物（0.012 mL）。一個小瓶就足以制成一個盤子的共軛物。共軛物必須在同一天使用，不應儲存以備日后使用。

標準：將5根微管標記為標準1至標準5。稀釋樣品稀釋液的全部內(nèi)容儲備緩沖液（25 mL）和225 mL去離子水，得到終體積為250 mL的1倍樣品稀釋液緩沖器將0.9 mL樣品稀釋緩沖液加入標準品1至5的微管中。降速封閉

14,15-DHET標準小瓶（2μL，填充惰性氣體），加入1.998 mL樣品稀釋緩沖液，獲得2 mL解決方案。給本標準貼上標簽6。將0.1mL標準品6添加到標有標準品5的微管中并混合非常接下來，將0.1mL標準品5加入標有標準品4的微管中，并充分混合。繼續(xù)到使用1:10稀釋液對其余標準品進行連續(xù)稀釋。

樣品：如果樣品在溶液中，可以直接稀釋到1倍樣品稀釋緩沖液中。用于提取和干燥的樣品，建議用少量的N，N二甲基甲酰胺乙醇（DMF，10μL至20μL）溶解干燥的樣品并充分渦旋。ELISA測定，加入100μL的1 X樣品稀釋緩沖液，使儲備樣品溶液準備好用ELISA進行定量。庫存樣品溶液可以進一步稀釋到用于ELISA測試的適當濃度范圍。

來源：https://www.amyjet.com/brand/Detroit-R-D.shtml