艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒原理：

FLICA試劑FAM-YVAD-FMK（Ex/Em = 488nm/530nm），是無細胞毒性的，細胞膜滲透抑制劑。進入每個細胞，并不可逆地與活化的caspase-1結(jié)合。任何未結(jié)合的FAM-YVAD-FMK-FLICA試劑擴散出細胞并被沖走。因此留在細胞內(nèi)的綠色熒光直接體現(xiàn)了活性caspase-1酶活性的。熒光結(jié)果可通過熒光酶標儀、熒光顯微鏡、流式細胞儀進行分析。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析試劑盒組分：

推薦的材料：

•DMSO，每小瓶50µL，用于重建FLICA

•DiH20，135-540 mL，稀釋10X凋亡洗滌緩沖液

•磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）pH 7.4，高100mL，稀釋FLICA并處理細胞

•處理細胞時，將FBS和/或BSA添加到緩沖液中

•在實驗條件下處理的培養(yǎng)細胞或組織可隨時標記

•誘導(dǎo)胱天蛋白酶活性并產(chǎn)生對照品如星孢菌素（#6212），喜樹堿（#6210）或尼格瑞林（#6698)

•90%乙醇或3%甲醛，產(chǎn)生活/死碘化丙啶染色對照

•黑色96孔微量滴定板，平底，未處理，非無菌（ICT目錄#266）。如果使用底部讀數(shù)儀器，使用黑色板墻壁和透明的底部。如果在使用無菌黑色組織培養(yǎng)板。

•血細胞儀

•200 x g離心

•15 mL聚丙烯離心管（每個樣品）

Caspase-1活性分析試劑盒檢測設(shè)備：

可通過以下方法分析分析：

•熒光顯微鏡

•熒光板讀取器

•流式細胞儀

使用接近這些設(shè)置的過濾器對：

•FAM-FLICA佳激發(fā)波長為488-492 nm，峰值發(fā)射波長為515-535納米。

•在長通濾波器下觀察碘化丙啶（PI）488-492nm，發(fā)射>610nm；核結(jié)合PI在617nm處具有大發(fā)射。

•使用365 nm激發(fā)的紫外濾光片可以看到Hoechst 33342以及480nm的發(fā)射。

實驗準備：

用FLICA染色細胞可以在幾個小時內(nèi)完成。然而FLICA用于活細胞，需要定期維護和提幾天栽培。此外，一旦正確的數(shù)字已經(jīng)培養(yǎng)了個細胞，必須為實驗分配時間治療或半胱天冬酶激活過程。創(chuàng)建細胞群，例如：

a、 暴露于實驗處理的細胞

b、 接受安慰劑的陰性對照細胞群

當FLICA檢測到催化活性形式的胱天蛋白酶時酶，計劃實驗，以使FLICA在細胞中預(yù)期胱天蛋白酶被激活時被稀釋和給藥。30X FLICA的推薦體積為每300µL細胞10µL3-5 x 105細胞/mL，但數(shù)量可能因?qū)嶒灦悧l件和用于分析的儀器。每位研究者應(yīng)調(diào)整FLICA的量以適應(yīng)特定細胞系研究條件。將細胞培養(yǎng)至適合特定實驗條件的佳密度或凋亡誘導(dǎo)方案。細胞密度不應(yīng)超過106細胞/超過此濃度培養(yǎng)的細胞可開始自然生長進入凋亡。可能需要進行初步實驗來確定何時以及使用多少FLICA作為產(chǎn)生的正信號是培養(yǎng)過程中caspase活性的直接測量。

來源：https://www.amyjet.com/products/ICT-97.shtml