多種花青 5.5 (Cy5.5®) 染料已用于標(biāo)記生物分子，用于熒光成像和其他基于熒光的生化分析。它們廣泛用于標(biāo)記肽、蛋白質(zhì)和寡核苷酸等。Cy5.5® 染料是常見(jiàn)的紅色熒光團(tuán)之。Cy5.5® NHS 酯很容易與氨基反應(yīng)。AAT Bioquest 提供三乙銨鹽形式的 Cy 染料 NHS 酯，與其他些供應(yīng)商提供的相應(yīng)鉀鹽相比，它們更易溶于 DMSO 和 DMF。Cy 染料三乙基銨鹽具有相同的反應(yīng)性，并得到與 Cy 染料鉀鹽相同的綴合物。Cy5.5® 是 GE Healthcare 的商標(biāo)。

1. 蛋白質(zhì)原液（溶液 A）

將 100 µL 反應(yīng)緩沖液（例如，1 M 碳酸鈉溶液或 1 M 磷酸鹽緩沖液，pH ~9.0）與 900 µL 目標(biāo)蛋白溶液（例如抗體，如果可能，蛋白濃度 >2 mg/mL）混合，得到 1 mL 蛋白質(zhì)標(biāo)記原液。注意：蛋白質(zhì)溶液（溶液 A）的 pH 值應(yīng)為 8.5 ± 0.5。如果蛋白質(zhì)溶液的 pH 值低于 8.0，則使用 1 M 碳酸氫鈉溶液或 1 M pH 9.0 磷酸鹽緩沖液將 pH 值調(diào)節(jié)到 8.0-9.0 的范圍內(nèi)。筆記：蛋白質(zhì)應(yīng)溶解在 1X 磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，pH 7.2-7.4。如果蛋白質(zhì)溶解在 Tris 或甘氨酸緩沖液中，則必須對(duì) 1X PBS，pH 7.2-7.4 進(jìn)行透析，以去除廣泛用于蛋白質(zhì)沉淀的游離胺或銨鹽（如硫酸銨和乙酸銨）。注意：不純的抗體或用牛血清白蛋白 (BSA) 或明膠穩(wěn)定的抗體不會(huì)被很好地標(biāo)記。疊丨氮化鈉或硫柳汞的存在也可能干擾偶聯(lián)反應(yīng)。疊氮化鈉或硫柳汞可以通過(guò)透析或離心柱去除以獲得佳標(biāo)記結(jié)果。筆記：如果蛋白質(zhì)濃度低于 2 mg/mL，偶聯(lián)效率會(huì)顯著降低。為獲得佳標(biāo)記效率，建議使用 2-10 mg/mL 的終蛋白質(zhì)濃度范圍。

2. 花青 5.5 單琥珀酰亞胺酯原液（溶液 B）

將無(wú)水 DMSO 添加到花青 5.5 單琥珀酰亞胺酯的小瓶中，制成 10 mM 庫(kù)存溶液。通過(guò)移液或渦旋充分混合。注意：在開(kāi)始偶聯(lián)之準(zhǔn)備染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B）。及時(shí)使用。染料儲(chǔ)備溶液的長(zhǎng)期儲(chǔ)存可能會(huì)降低染料活性。溶液 B 在避光和防潮的情況下可在冰箱中保存兩周。避免凍融循環(huán)。

艾美捷Cy5.5單琥珀酰亞基酯 Cy5.5 NHS酯示例實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

該標(biāo)記方案是為山羊抗小鼠 IgG 與花青 5.5 單琥珀酰亞胺酯的偶聯(lián)物而開(kāi)發(fā)的。您可能需要進(jìn)步優(yōu)化您的特定蛋白質(zhì)。注意：每種蛋白質(zhì)都需要不同的染料/蛋白質(zhì)比例，這也取決于染料的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的過(guò)度標(biāo)記可能對(duì)其結(jié)合親和力產(chǎn)生不利影響，而低染料/蛋白質(zhì)比率的蛋白質(zhì)綴合物會(huì)降低靈敏度。

艾美捷Cy5.5單琥珀酰亞基酯 Cy5.5 NHS酯運(yùn)行偶聯(lián)反應(yīng)：

使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的 10:1 摩爾比作為起點(diǎn)：將 5 µL 染料儲(chǔ)備溶液（溶液 B，假設(shè)染料儲(chǔ)備溶液為 10 mM）添加到蛋白質(zhì)小瓶中溶液（95 µL 溶液 A），有效搖動(dòng)。假設(shè)蛋白質(zhì)濃度為 10 mg/mL 且蛋白質(zhì)的分子量為 ~200KD，則蛋白質(zhì)的濃度為 ~0.05 mM。注意：我們建議使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白質(zhì)）的 10:1 摩爾比。如果太少或太高，分別確定J佳染料/蛋白質(zhì)比例為 5:1、15:1 和 20:1。

在室溫下繼續(xù)旋轉(zhuǎn)或搖動(dòng)反應(yīng)混合物 30-60 分鐘。

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱純化染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的示例：

1.根據(jù)制造說(shuō)明制備 Sephadex G-25 色譜柱。

2.將反應(yīng)混合物（從“運(yùn)行共軛反應(yīng)”）加載到 Sephadex G-25 柱的頂部。

3.旦樣品在頂部樹(shù)脂表面下方運(yùn)行，立即添加 PBS (pH 7.2-7.4)。

4.向所需樣品中添加更多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成色譜柱純化。將含有所需染料-蛋白質(zhì)結(jié)合物的部分結(jié)合起來(lái)。注意：為了立即使用，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物需要用染色緩沖液稀釋，并分裝以供多次使用。注意：為了長(zhǎng)期儲(chǔ)存，染料-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液需要濃縮或冷凍干燥。

來(lái)源：https://www.amyjet.com/products/AAT-174.shtml