方法：植物樣品通常在研缽和杵中用液氮研磨。產(chǎn)生的粉末被轉(zhuǎn)移到塑料管中。藻類樣品可以通過離心或zui好通過過濾到玻璃纖維過濾器上進(jìn)行濃縮。在含有0.1mg/mL PefaBloc SC（AEBSF）蛋白酶抑制劑（羅氏）的Agrisera蛋白提取緩沖液（PEB，AS08 300）中進(jìn)行增溶。通過在液氮中對(duì)樣品進(jìn)行快速冷凍，并用微型針尖進(jìn)行超聲處理，以交替解凍，zui理想地獲得破壞。根據(jù)樣品的韌性，可重復(fù)此過程。將樣品調(diào)節(jié)至50 mM二硫蘇糖醇并加熱至70°C 5分鐘。在電泳，對(duì)樣品進(jìn)行短暫冷卻和離心。

根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的豐度，使用每個(gè)凝膠通道的中等樣本量（總蛋白質(zhì)通常為0.5至2.5 ug）實(shí)現(xiàn)zui佳定量。

電泳和免疫印跡：旦溶解，蛋白質(zhì)可以在許多系統(tǒng)中進(jìn)行電泳分離。我們使用使用Bis-Tris 4-12%梯度凝膠的Invitrogen NuPAGE凝膠系統(tǒng)獲得zui佳結(jié)果。根據(jù)制造商的建議，蛋白質(zhì)在MES SDS運(yùn)行緩沖液中在200 V下分離35分鐘。凝膠在同裝置（SureLock XCell blot module）中轉(zhuǎn)移至PVDF，單個(gè)凝膠在30 V電壓下轉(zhuǎn)移60分鐘，成對(duì)凝膠轉(zhuǎn)移80分鐘。轉(zhuǎn)移后，用TBS-T中含量不超過10%的無脂奶粉將污漬堵塞1 h/RT，輕輕攪拌。將印跡與抗體（通常為1:25 000至1:50 000）起孵育1 h/RT（如果使用J端femtogram檢測(cè)試劑），或在較低的抗體稀釋液中孵育較低靈敏度的試劑（中等皮克和較低）。

對(duì)于定量而言，相對(duì)較高的抗：靶蛋白比率比抗：靶蛋白比率較低的免疫印跡法提供更可靠的結(jié)果。

在TBS-T中廣泛清洗污漬（兩次短暫，次15分鐘，三次5分鐘）。將印跡與二抗體（例如山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物AS09 602（Agrisera））孵育1h/RT。如上所述清洗印跡并使用ECL檢測(cè)試劑顯影。

定量：當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)包括在印跡上時(shí)，可使用可用軟件對(duì)樣品進(jìn)行定量。使用Bio-Rad Fluor-S-Max或使用Bio-Rad QuantityOne軟件的同等儀器上采集的圖像可獲得J好的定量。輪廓工具用于選擇定量區(qū)域，并減去背景值，得出每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的調(diào)整體積（單位：計(jì)數(shù)）。使用上述協(xié)議，在目標(biāo)負(fù)載的1-1.5個(gè)數(shù)量范圍內(nèi)生成線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。需要注意的是，免疫檢測(cè)通常顯示強(qiáng)S形信號(hào)-負(fù)載響應(yīng)曲線，低負(fù)載跟蹤檢測(cè)區(qū)域、偽線性范圍和高負(fù)載飽和響應(yīng)區(qū)域。對(duì)于免疫定量而言，樣本中的目標(biāo)蛋白和標(biāo)準(zhǔn)曲線在偽線性范圍內(nèi)是至關(guān)重要的。我們使用該協(xié)議的總檢測(cè)范圍超過2個(gè)數(shù)量，但可量化范圍更窄。

艾美捷 PsbA|D1 protein of PSII應(yīng)用實(shí)例：

在4-12%NuPage（Invitrogen）LDS-PAGE上分離（1-4和6-8）原綠球菌的2µg總蛋白，用蛋白提取緩沖液PEB（AS08 300），（9-12）PsbA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（AS01 016S），（5）分子量標(biāo)記（魔術(shù)標(biāo)記，Invitrogen）提取，并在PVDF上印跡1h。在吐溫-20（TBS-T）中加入2%的封閉試劑攪拌1h/RT后，立即封閉印跡。將印跡以1:50000的稀釋度在抗體中攪拌培養(yǎng)1h/RT。傾析抗體溶液，將印跡短暫沖洗兩次，然后在室溫下攪拌，在TBS-T中洗滌次15分鐘，洗滌3次5分鐘。在二抗體（抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物）中培養(yǎng)印跡，稀釋至1:10000 in，攪拌1h/RT。按照上述方法清洗印跡，并根據(jù)制造商說明使用ECL檢測(cè)試劑顯影5分鐘。使用CCD成像儀（FluorSMax，Bio-Rad）和Quantity One軟件（Bio-Rad）獲得斑點(diǎn)圖像。在原綠球菌樣品中，PsbA的各種較小的C-末端裂解產(chǎn)物很明顯；這些都是真實(shí)的，并且根據(jù)治療和生長(zhǎng)條件的不同，它們的變化方式也不盡相同。

Agrisera公司提供的植物域的抗體涵蓋擬南芥、萊茵衣藻、藍(lán)藻、松柏類、硅藻、大豆、大麥、蒺藜苜蓿等等。艾美捷科技是Agrisera的中國(guó)代理商，為科研工作者提供優(yōu)質(zhì)的PsbA|D1 protein of PSII。