染料法貓血支原體實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma haemofelis

貨號：Mqs-hfe-20    20個反應

貨號：Mqs-hfe-50    50個反應

貨號：Mqs-hfe-100    100個反應

儲存：-20度，避光保存，有效期年。避免反復凍融。

試劑盒特點：

1， 特異性識別貓血支原體和犬血支原體，不受貓和犬的其他寄生微生物的干擾。

2， 使用熱啟動的Taq酶，可抑制非特異性擴增，降低背景熒光。

3， 帶有陽性對照樣品（組分C），可用于檢驗試劑盒有效性，以及驗證待測樣品中是否含有PCR抑制劑。

4， 帶有ROX參比染料，幫助校正加樣誤差和管間差異。

5， 帶有UDG酶和dUTP，可降低殘留DNA的污染。

貓血支原體（Mycoplasma haemofelis），或稱為貓嗜血支原體、貓附紅細胞體，寄生于貓紅細胞表面，具多形性，可呈現(xiàn)為球狀、環(huán)狀或桿狀，對紅細胞有破壞作用，可引起傳染性溶血貧血癥，有時呈急性發(fā)作，可致命；有時呈慢性發(fā)作，出現(xiàn)嗜睡、厭食、粘膜慘白及黃疸、發(fā)燒、脾臟腫大等癥狀，并可能出現(xiàn)反復發(fā)作。其傳播途徑為血液傳播，包括：吸血昆蟲叮咬、咬傷、輸血等。

目已知寄生于貓血中的支原體有三種：貓血支原體，Candidatus Mycoplasma haemominutum和Candidatus Mycoplasma turicensis；在PCR技術出現(xiàn)之，這三種支原體被統(tǒng)稱為貓血巴爾通氏體（Haemobartonella felis）。有報道約14%的貧血貓呈血液支原體陽性。貓血支原體的致病能力強于貓血中的另兩種支原體。

寄生于犬血中的支原體有兩種：犬血支原體（Mycoplasma haemocanis)和Candidatus Mycoplasma haemaarvum。犬血支原體與貓血支原體親緣關系非常近，形態(tài)也類似。在實驗條件下，貓可以感染犬血支原體，而犬不能感染貓血支原體。犬血支原體感染后有時不表現(xiàn)出癥狀，有時可能引起些癥狀，包括：脫水、輕度貧血、心跳過速、黃疸、死亡，但是很少引起明顯的溶血，除非是做了脾切除手術或者發(fā)生了免疫抑制。犬血支原體是犬類中常見的嗜血支原體，分布為廣泛，陽性率大約在0.5-40%之間。

常用的檢測方法包括顯微鏡鏡檢法和PCR法。鏡檢法靈敏度低，實驗誤差大，無法區(qū)分支原體種類，易受血液中其他物質(zhì)以及人工涂片方法的干擾，且支原體易從紅細胞表面脫落，造成漏檢。而PCR法在靈敏度上則有明顯的優(yōu)勢，且可以區(qū)分支原體種類。定量PCR法與普通PCR法相比，不僅可以精確定量，而且操作更為方便，更少受環(huán)境污染的影響。

本試劑盒針對貓血支原體的16S rRNA基因的保守區(qū)域，設計特異性引物，可準確識別貓血支原體和犬血支原體,僅與Mycoplasma haemobos有交叉反應。Mycoplasma haemobos寄生于牛血中，不會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生影響。對320只貓的檢測表明，嗜血支原體的總陽性率為43.4%，貓血支原體的陽性率為12.8%。

本試劑盒包含熱啟動Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、陽性對照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準備好DNA樣品即可使用。

熱啟動Taq酶結合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶，在室溫下聚合酶活性被抗體抑制。在PCR循環(huán)的變性階段，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復，因此獲得“熱啟動”功能，可減少殘余DNA的污染，提高PCR擴增效率、靈敏度和目的片段產(chǎn)量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結合，結合后在497nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生520nm的發(fā)射光。未結合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產(chǎn)生熒光。因此可以根據(jù)熒光值的大小判斷溶液內(nèi)DNA雙鏈的多寡，用于實時檢測PCR反應過程中產(chǎn)物的累積量。初始模板濃度越高，反應循環(huán)數(shù)越高，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以結合非特異性PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，此時產(chǎn)生的熒光與目標擴增產(chǎn)物無法區(qū)分。為了判斷熒光信號是否來自目標擴增產(chǎn)物，可以繪制熔解曲線。通過逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA，同時檢測熒光值的變化，繪制曲線，根據(jù)熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止次步驟殘余DNA的擴增。dUTP可以確保擴增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環(huán)開始的UDG孵育步驟，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產(chǎn)物。經(jīng)過該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環(huán)過程中被高溫滅活，對PCR反應沒有影響。

ROX不參與PCR反應，在PCR反應過程中熒光沒有變化，可以提供條基線用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內(nèi)參ROX熒光的比值，使定量更準確。ROX染料的激發(fā)波長為584nm，發(fā)射波長為612nm。用ROX進行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右。

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