染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination

貨號：Myco-qs-20，規(guī)格：20個反應(yīng)

貨號：Myco-qs-50，規(guī)格：50個反應(yīng)

貨號：Myco-qs-100，規(guī)格：100個反應(yīng)

儲存：-20度，避光保存，有效期年。避免反復(fù)凍融。

試劑盒特點：

1，本試劑盒對柔膜菌綱（包括支原體、螺原體和無膽甾原體）有強(qiáng)的特異性，與柔膜菌綱以外的其他基因組無交叉反應(yīng)。

2，本試劑盒靈敏度高，低可檢出反應(yīng)液中2-4個基因組。

3，本試劑盒使用熱啟動的Taq酶，可抑制非特異性擴(kuò)增，降低背景熒光。

4，本試劑盒帶有陽性對照樣品（組分C），可用于檢驗試劑盒有效性，也可用于驗證待測樣品中是否含有PCR抑制劑。

5，本試劑盒帶有ROX參比染料，幫助校正加樣誤差和管間差異。

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜菌（Mollicutes）綱,直徑約0.1-0.3 µm,具有變形能力，因此可以輕易穿過常規(guī)的0.22 µm無菌濾膜,是常見的動物細(xì)胞培養(yǎng)污染源。由于支原體體積太小，在光學(xué)顯微鏡下不可分辨，因此細(xì)胞常常在不知不覺中被污染。

目的經(jīng)典檢測方法是歐洲藥典（European Pharmacopeia）2.6.7規(guī)定的體外培養(yǎng)法，用特殊培養(yǎng)基對支原體進(jìn)行培養(yǎng)，以此檢測污染情況。培養(yǎng)法的優(yōu)點是檢測靈敏度高，缺點是耗時較長，長的需要28天之久，而且受操作人員的技能水平影響較大，不同實驗室的檢測誤差較大。隨著生物制藥業(yè)的發(fā)展，很多生物制品保質(zhì)期較短，因此需要種快速、靈敏并且特異性強(qiáng)的支原體檢測方法。歐洲藥典因此接納了核酸檢測方法作為培養(yǎng)法的替代方案。定量PCR法可以在幾個小時內(nèi)完成檢測，靈敏度與培養(yǎng)法相當(dāng)，甚至更好。

本試劑盒以16S rRNA基因為靶點，設(shè)計了多對引物，可檢出大部分已知的支原體，以及部分螺原體和無膽甾原體，與親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌，如鏈球菌、梭菌、乳桿菌等，沒有交叉反應(yīng)，在檢測范圍和特異性方面達(dá)到歐洲藥典的要求。歐洲藥典提及的所有支原體均在本試劑盒的檢測范圍內(nèi)。靈敏度方面，低檢測值可以達(dá)到每個反應(yīng)2-4個基因組，在不考慮DNA提取損耗的情況下，達(dá)到歐洲藥典要求的10 CFU/mL的低檢測值。

本試劑盒包含熱啟動Taq酶、dNTP（以UTP代替了TTP）、引物、陽性對照品、SYBR Green I染料、ROX染料，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準(zhǔn)備好DNA樣品即可使用。

注意事項：

1，本產(chǎn)品僅限于科研使用，不作診斷用途。

2，操作過程中應(yīng)注意防范樣品之間的串聯(lián)污染。好對工作區(qū)域進(jìn)行劃分，將不同步驟，如DNA提取和PCR反應(yīng)液的配制，分開在不同階段不同區(qū)域進(jìn)行。使用無污染的次性槍頭，好是帶濾芯的槍頭。好在通風(fēng)區(qū)域操作，操作時須佩戴無粉塵手套。

3，對于在584 nm附近可產(chǎn)生激發(fā)光的儀器（大部分使用鎢燈或鹵素?zé)糇鳛楣庠吹膬x器，還有些儀器門配置了LED燈，可激發(fā)~584 nm光源），ROX的反應(yīng)濃度為30-50 nM。對于不能在584 nm附近可產(chǎn)生激發(fā)光的儀器（大部分以激光為光源的儀器），ROX的反應(yīng)濃度為300-500 nM。具體可參考儀器的使用手冊。

熱啟動Taq酶結(jié)合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶，在室溫下聚合酶活性被抗體抑制。在PCR循環(huán)的變性階段，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復(fù)，因此獲得“熱啟動”功能，可減少殘余DNA的污染，提高PCR擴(kuò)增效率、靈敏度和目的片段產(chǎn)量。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結(jié)合，結(jié)合后在497nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生520nm的發(fā)射光。未結(jié)合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產(chǎn)生熒光。因此可以根據(jù)熒光值的大小判斷溶液內(nèi)DNA雙鏈的多寡，用于實時檢測PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)物的累積量。初始模板濃度越高，反應(yīng)循環(huán)數(shù)越高，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高。值得注意的是，SYBR Green I也可以結(jié)合非特異性PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，此時產(chǎn)生的熒光與目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物無法區(qū)分。為了判斷熒光信號是否來自目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以繪制熔解曲線。通過逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA，同時檢測熒光值的變化，繪制曲線，根據(jù)熒光值觀察DNA解鏈的溫度。

UDG和dUTP可以阻止次步驟殘余DNA的擴(kuò)增。dUTP可以確保擴(kuò)增后的DNA中均含有尿嘧啶。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環(huán)開始的UDG孵育步驟，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產(chǎn)物。經(jīng)過該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環(huán)過程中被高溫滅活，對PCR反應(yīng)沒有影響。

ROX不參與PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)過程中熒光沒有變化，可以提供條基線用于校正加樣誤差和管間差異，便于儀器自動分析報告熒光與內(nèi)參ROX熒光的比值，使定量更準(zhǔn)確。ROX染料的激發(fā)波長為584nm，發(fā)射波長為612nm。用ROX進(jìn)行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右。

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